未经修饰的DNA寡核苷酸以及用C3-氮化和CY3B修饰的DNA寡核苷酸购自MWG Eurofins和Sperabion。M13MP18和P7560支架是从Tilibit获得的。氯化镁（1 m，no。Am9530g），氯化钠（5 m，no。Am9759），超纯水（第10977-035号），Tris（1 m，pH 8.0，no。Am9855g），EDTA（0.5 m，pH 8.0，ph 8.0，ph 8.0，no。Am9260g）和10 001零售店（no。Am9260G）和10×pbs（费舍尔科学。从Sigma-Aldrich订购了BSA（第A4503-10G号）。Triton X-100（第6683.1号）购自Carl Roth。氢氧化钠（第31627.290号）购自VWR。从电子显微镜科学获得了多聚甲醛（第15710号）和戊二醛（第16220号）。Tween-20 (no. P9416-50ML), glycerol (no. 65516-500 ml), methanol (no. 32213-2.5L), protocatechuate 3,4-dioxygenase pseudomonas (PCD, no. P8279), 3,4-dihydroxybenzoic acid (PCA, no.从Sigma-Aldrich订购了37580-25G-F）和（±）-6-Hydroxy-2,7,8--tetra-甲基氯乙烯-2-羧酸（Trolox，No。238813-5G）。中性素（第31000号）购自Thermo Fisher Scientific。生物素标记的BSA（第A8549号）和叠氮化钠（第769320号）是从Sigma-Aldrich获得的。Cofferslips（第0107032号）和载玻片（第10756991号）分别购自Marienfeld和Thermo Fisher Scientific。Fetal bovine serum (FBS, no. 10500-064), 1× PBS (pH 7.2, no. 20012-019), 0.05% trypsin-EDTA (no. 25300-054), salmon sperm DNA (no. 15632011), OptiMEM (no. 31985062) and Lipofectamine LTX (no. A12621) were purchased fromThermo Fisher科学。从细胞诊断中订购了金纳米颗粒（90 nm，no。g-90-100）。针对GFP（克隆1H1）用单个异位半胱氨酸在C末端的纳米生物剂以特定于位点特异性共轭购买。DBCO-PEG4-Maleimide（No。CLK-A108P）购自Jena Bioscience。
以下缓冲液用于样品制备和成像。
通过将100 mg的Trolox添加到430μl的100％甲醇和345μl的1 M NaOH中，在3.2 mL的水中加入100 mg Trolox（100×）。PCA（40×）是通过将154毫克的PCA混合在10毫升水和NaOH中，并将pH调节至9.0制成。PCD（100×）是通过将9.3 mg的PCD添加到13.3 mL缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mm KCl，1 mM EDTA，50％甘油）制成。
四个正交DNA序列基序用于在四个RESI回合中标记目标。对接链为5XR1（TCCTCCTCTCCTCCTCT），5XR2（Accaccaccaccaccaccacca），7xR3（ctctctctctctctctc）和7xr4（acacacacacacacacacaca）。相应的成像器为R1（Aggagga-Cy3b），R2（TGGTGGT-CY3B），R3（Gagagag-Cy3b）和R4（TGTGTGT-CY3B）。2D RESI折纸的设计需要在5'端的R1位点扩展，以使相邻的R1和R3对接链可以通过单基对分开。因此，使用了对接链5'5xr1（TCCTCCTCCTCCTCCT）和5'R1成像仪（CY3B-AGGAGGA），而不是两种2D DNA折纸的3'版本。
所有2D DNA折纸结构均在Cadnano40中设计。DNA折纸的自组装是在一锅反应混合物中完成的，总体积为40μl，由10 nm的脚手架链组成（有关序列，请参见补充数据2），100 nm折叠钉钉（补充数据1），500 nm生物素化的钉书钉（补充数据1）和1μm-spaple staple staple staple staple strands inters inte nime s nime grands strands inte unds strands intect s retand strands s restect ins inte unds。DNA折纸折叠缓冲液。然后将反应混合物使用热环体进行热退火坡道。首先，将其在80°C下孵育5分钟，使用温度梯度从60到4°C的温度梯度以每3.21分钟1°C的步骤冷却，最后保持在4°C。
3D DNA折纸磁盘结构是在Cadnano40中设计的。DNA折纸盘的自组装是在50 µl总体积的一锅反应混合物中完成的，由20 nm脚手架链组成，包括20 nm脚手架p7560 p7560（有关序列，请参见序列数据3），200 nm核心折叠订书钉（补充数据1），补充数据1），无需扩展数据1，补充数据1），辅助数据1），500 NM，500 NM，500 NM，500 NM，500 NM，500 NM，500 nm，500 NM，500 NM，5 nm nm，5 nm nm，nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm nm。带有R4对接位点扩展的2μM主链链和3D DNA折纸折叠缓冲液中的R1或R3对接位点扩展（补充数据1）的4μM主链链。然后将反应混合物使用热环体进行热退火坡道。首先将其在80°C下孵育5分钟，然后使用从60°C到20°C的温度梯度以1°C H – 1的速度冷却，并最终保持在20°C。
自组装后，通过琼脂糖凝胶电泳（1.5％琼脂糖，1×TA，10 mM MGCL2，0.5×sybrsafe）在4.5 V cm – 1中纯化结构。1.5h。切割，压碎凝胶带，折纸在-20°C下存储在低结合的eppendorf管中。
为了进行样品制备，将无底的六通道载玻片（Ibidi，编号80608）连接到盖玻片上。首先，将80μl的生物素标记的BSA（1 mg ML – 1，溶解在缓冲液中）被冲入腔室中，并孵育5分钟。然后将腔室用360μl的缓冲液A洗涤。然后将100μl中性蛋白（0.1 mg ml – 1，溶解在缓冲液A中）的体积将其冲洗到腔室中，并允许结合5分钟。用180μl的缓冲液A洗涤后，随后用360μl的缓冲液B洗涤，在缓冲液B中洗涤80μl生物素标记的DNA结构（约200 pm），将其冲入室内并孵育5分钟。为了测量DNA折纸盘，将额外的2D DNA折纸结构与12个目标位点9相距20 nm的折纸结构一起孵育在一起，3D磁盘折纸用作漂移校正的基准。After DNA origami incubation the chamber was washed with 540 μl of buffer B. For DNA origami disk structures, 150 μl of gold nanoparticles (diluted 1:10 in buffer B) was flushed through and incubated for 5 min before washing with 540 μl of buffer B. Finally, 180 μl of the imager solution in buffer B was flushed into the chamber.腔室仍充满成像剂溶液，然后进行成像。在成像弹之间，将样品用1 mL的缓冲液B洗涤3次，直到未检测到先前成像剂溶液中的残留信号为止。然后，引入了下一个成像器解决方案。对于RESI，对第1轮中存在的Imager R1和R4进行了两个成像弹，并且在第2轮中的Imagers R3和R4（R1和R3探测了RESI和R4感兴趣的位点，R4具有对齐目的）。
如先前所述32。在冰上解冻未结合的纳米化合物，然后加入20倍过量的双功能DBCO-PEG4-Maleimide接头，并在冰上反应2小时。使用Amicon离心过滤器（10,000 MWCO），通过缓冲区交换向PBS换取未反应的链接器。将DBCO修饰的纳米化合物与5×摩尔过量的叠氮化官官能化DNA（R1，R2，R3和R4）反应过夜，在4°C下过夜。使用配备有资源Q 1 ml柱的äkta纯系统通过阴离子交换色谱法除去未结合的蛋白质和游离DNA。
在Gibco Ham的F-12K（Kaighn's）培养基中培养CHO细胞（CCL-61，ATCC），该培养基补充了10％FBS（编号11573397，Gibco）。在麦考伊的5A培养基（Thermo Fisher Scientific，No。16600082）中培养了U2OS-Crispr-NUP96-MEGFP细胞（来自RIES和Ellenberg Laboratories的礼物），并补充了10％FBS。使用胰蛋白酶-EDTA每2-3天传递一次细胞。
将U2OS-CRISPR-NUP96-MEGFP细胞播种在Ibidi八孔高玻璃底室（第80807号），密度为30,000 cm – 2。在室温下用2.4％多聚甲醛在PBS中用2.4％多聚甲醛固定细胞。固定后，用PBS将细胞洗涤3次。将金纳米颗粒（200μl）孵育5分钟，并用PBS洗涤3次。在阻塞缓冲液中用0.25％Triton X-100进行阻塞和透化90分钟。用PBS洗涤后，将细胞与100 nm抗GFP纳米结构孵育，以在室温下阻止缓冲液60分钟。为了启用RESI，纳米机溶液由25 nm R1，R2，R3和R4 docking-strand耦合的抗GFP纳米型组成，总纳米型浓度为100 nm。通过用PBS洗涤3次去除未结合的纳米生物，然后用缓冲液C洗一次10分钟。在PBS中用2.4％多聚甲醛进行后缀15分钟。用PBS洗涤3倍后，将缓冲液C中的成像剂溶液冲入腔室中。在成像弹之间，将样品用1-2 mL的PBS洗涤，直到未检测到先前成像剂溶液的残留信号为止。然后，引入了下一个成像器解决方案。首先，将Imagers R1，R2，R3和R4同时添加到样品中，以执行标准的DNA仪测量。然后，RESI成像是通过仅使用一个成像器的四个随后的成像弹进行的。
MEGFP-ALFA-CD20通过将Alfa-CD20插入MEGFP-C1质粒（第54759号，addgene）插入。用引物CGGCATGGACGAGCT和GTACAAGTCCGGA放大Alfa-CD20 Gblock（从集成的DNA技术获得），并在用限制性酶BSRGI和BAMHI切割后，进行了Gibson组装（2x Mix，NEB，NEB）。
CHO细胞被种植在同上八孔高玻璃底室（第80807号），以15,000 cm – 2的密度转染前一天。用MEGFP-CD20的转染使用Lipofectamine LTX进行，如制造商所指定。CHO细胞被允许表达MEGFP-CD20 16-24 h。然后，将培养基替换为新鲜的F-12K培养基+10％FBS（在未经处理的情况下）或F-12K培养基+10％FBS+10％FBS+10 UG ML – 1 RTX-ALEXA 647（Roche Glycart的礼物）（在RTX处理的情况下），然后再孵育30分钟。用新鲜培养基两次洗涤5分钟后，用250 µL预热的4％PFA+0.1％戊二醛在PBS中固定细胞15分钟。用PBS将CHO细胞洗涤3次，并用100 mM Tris pH 8.0淬火5分钟。在PBS中使用0.2％Triton X-100进行透化5分钟，然后用PBS洗涤3次。在室温（RT）的阻止缓冲液中阻断细胞1小时。在4°C下以25 nm的总浓度在25 nm的总浓度下孵育抗GFP纳米体。对于带有四轮的RESI，GFP-NB-R1/2/3/4的RESI每发均产生6.25 nm。用RT用PBS洗涤3次后，将细胞用4％PFA在RT后固定10分钟，然后用如上所述洗涤和固定后固定。将金纳米颗粒（90 nm）在PBS中稀释1：3，并在RT中孵育10分钟，并用PBS洗涤样品两次以去除未结合的金。将第一轮缓冲液C中的成像剂溶液孵育5分钟，然后用新鲜成像仪代替，然后开始了第一轮。在成像弹之间，将样品用至少2 mL PBS洗涤，直到未检测到先前成像剂溶液的残留信号为止。然后，引入了下一个成像器解决方案。RESI成像是通过仅使用一个成像器的四个随后的成像弹进行的。在最后的成像中，Imagers R1，R2， 同时将R3和R4添加到样品中，以执行标准的DNA绘制测量。
使用倒置显微镜（Nikon Instruments，Eclipse Ti2）进行荧光成像，以完美的焦点系统，应用配备有油式物镜（Nikon Instruments，Apo Sr Tirf×100/Numerical Aprerical 1.49）的客观类型TIRF配置（nikon Instruments）。使用560 nm激光（MPB通信，1 W）进行激发。激光束通过清理过滤器（Chroma Technology，No。Zet561/10），并使用梁分离器（Chroma Technology，no。ZT561RDC）耦合到显微镜物镜。用发射过滤器（Chroma Technology，ET600/50M和ET575LP）频谱过滤荧光，并在SCMOS摄像头（Andor，Zyla 4.2 Plul）上成像，而无需进一步放大，从而导致有效的像素大小为130 nm（2×2 binning之后）。读数率设置为200 MHz。通过选择一个尺寸512×512像素的区域获得图像。使用检测路径中的圆柱形透镜（Nikon Instruments，N-STORM）进行3D成像。使用μmanager41（v.2.0.1）获取原始显微镜数据。总内部反射照明用于2D和3D DNA折纸数据以及CD20采集。采用高度倾斜和层压的光学表（HILO）照明来获取NPC数据。相应实验的详细成像条件在扩展数据表1中显示。
由于目标和样品异质性，用于实现稀疏闪烁的最佳成像仪浓度C各不相同。在这里，我们使用了从100 pm（NUP96）到800 pm（DNA折纸）的浓度。为每个样品视觉确定最佳成像仪浓度。改变浓度，直到闪烁频繁，但足够稀疏，以达到良好的DNA绘制分辨率。
在DNA绘制测量过程中，每个结合位点的预期结合事件的平均数量由测量测量的持续时间和平均黑暗时间τdark（定义为，KON是给定成像器链的速率）给出的，为：：
每个结合事件的平均本地化数量由平均明亮时间τbright和相机曝光时间texposigs给出
因此，在测量过程中，每个结合位点预期的平均局部数量是
因此，收集NLOC本地化所需的总获取时间平均是
使用DNA-Paint定位精度σDNA-Paint计算必要数量的NLOC数量NLOC。
对于预期成像仪的浓度在50至800 pm之间，在100至200 ms和动力学之间的暴露时间在32之前报道，收集16个本地化所需的时间（1 nm Resi Precision给定σDNA-Paint = 4 nm）在42 s（r2，800 pm，100 ms的暴露时间）和314分钟和314分钟（R5，50 pm，200 ms，200 ms曝光时间）之间变化。
使用Picasso软件包9（可在https://github.com/jungmannlab/picasso中找到最新版本），对原始荧光数据进行了超分辨率重建。用冗余的互相关和金颗粒作为细胞实验的基金会或单个DNA粉末对接位点作为折纸实验的基金会进行漂移校正。
随后的成像弹对齐是在Picasso9中迭代进行的，从冗余的交叉相关开始，然后进行细胞实验的金基准比对。每个DNA折纸都配备了其他DNA漆对接位点，它们与所有成像弹相关的位点同时成像，从而使它们可以用作基金会。首先，在毕加索渲染中进行了冗余的互相关（2D和3D折纸测量）和金对齐（3D测量）。为了纠正缓冲液交换过程中单个DNA折纸的纳米镜移动，通道比对不仅在整个视野上进行，而且还选择了仅包含一个DNA折纸的小区域。然后，在每个感兴趣的区域内，通过DNA折纸的基准对接部位进行比对。这是在毕加索以自定义python脚本以外进行的，不仅是为了找到通道之间的最佳翻译，而且还可以校正DNA折纸的可能旋转。
通道对齐后，使用每次成像弹的自定义聚类算法分析DNA-Paint数据。该算法是基于以下事实：在DNA-Paint中，定位是对目标分子位置的独立测量，并被认为是高斯分布。为了将本地化分配给特定的目标分子，我们首先使用梯度上升方法来为每个目标找到定位云的中心。然后，我们分配了所有循环分布在中心点围绕中心点的局部化的定位。这是一个有效的近似值，因为由于通过RESI的顺序成像方法降低了有效目标密度，因此来自单个目标的大多数定位云足够分开。
聚类算法使用两个输入参数：RADIUS R，该参数设置了簇的最终大小，并定义了每个定位周围的圆形环境，以及最小数量的位置数字，NMIN，代表任何群集中DNA paintizations次数的较低阈值。
首先，计算了距每个本地化距离R内的相邻本地化数量。如果给定的定位在其R半径内的邻居比所有邻近的本地化都多，则被认为是局部最大值。如果在这样的局部最大值周围半径r的圆圈内有不止NMIN的定位，则将这些本地化分配给同一群集；其余的不被认为是集群的一部分，并且从进一步的分析中省略了。
进行簇的进一步过滤以排除簇的簇，这些簇源自将成像器的非特异性粘贴到样品中。首先，计算所有分配给同一群集的本地化的平均框架（发生定位的帧数的平均值（平均值）。在重复眨眼的情况下，平均帧预计将是帧总数的一半。因此，该算法在第一个或最后20％的框架中排除了所有均值框架的所有簇。其次，可以通过将获取时间分为20个窗口，每个窗口中包含5％的框架，可以识别出收购时间中间的粘性事件。如果这些时间Windows中的任何一个都包含群集中的80％以上的本地化，则将其排除在一个粘性事件中。
聚类半径R和阈值Nmin的选择取决于相应的实验条件。可以通过在毕加索渲染中挑选出源自单个目标分子（即良好分开）的定位云来估算NMIN的合适值，从而导出挑选属性并绘制每个选拔中本地化数量的直方图。选择Nmin以区分与单个目标和背景定位相对应的人群。
半径为r缩放的尺度，其本地化云的大小，因此缩放了定位精度。如果选择了一个值，则可能不会分开相邻的簇；如果R太小，则可能会在一个本地化中进行“子集群”。后者也将峰值的峰值转化为簇半径的两倍。R的良好A先验起始值表示约为基础DNA-Paint测量的定位精度。毕加索渲染提供了一种工具（测试凝聚器），其中可以测试不同聚类参数的效果。
对于3D聚类，引入了Z方向的额外半径，因为与X和Y相比，Z中局部化的扩散大约要大约两倍。
经过群集分析后，通过使用平方逆定位精度作为权重来计算DNA-Paint定位组的中心作为加权（WTD）平均值。对于X和Y坐标：
对于Z坐标，使用无重量的标准平均值来计算Z位置。由此产生的RESI定位的精度是加权S.E.M.基础分组的本地化：
AS权重的选择是基于以下参数：在以下假设：定位是独立且正态分为平均值的假设下，基于逆差异的加权平均值作为权重是整个本地化集合平均值的最大似然估计器。因此，当选择单个测量值的逆差异作为权重时，加权平均值的方差是最小的（估计器是最佳的）。
最后，我们采用了由此产生的X和Y S.E.M.的平均值。作为每个RESI本地化的最终精度。对于z坐标，估计精度为两倍xy精度。在毕加索HDF5文件中保存RESI本地化，使我们能够将它们作为S.D.对应于它们各自的精度。
为了评估RESI的性能，进行了硅数值模拟。该算法包括以下步骤。
为了评估在实验数据中RESI的精度，使用了一种类似的方法。简而言之，将与单个结合位点相对应的每个组的DNA粉状局部化的总数随机重新采样到k局部化的子集中，然后进行了上面的步骤4和5以评估σResi。图3D中绘制的σResi是数据集中所有单个结合位点的平均值。错误条代表S.D.针对不同结合位点计算的不同σResi值。
请注意，此分析只能针对K进行<< M to have sufficient RESI localizations for a statistically significant estimation. Because final RESI localization takes into account all M DNA-PAINT localizations, final precision is extrapolated as .
In RESI, the sparsity of binding sites in the sample is achieved by labelling a single species of biomolecules with different orthogonal DNA sequences. The labelling process is performed in a stochastic manner: n different labels (for example, DNA-conjugated nanobodies) targeting the same protein species are simultaneously incubated in the sample and thus the probability of each single protein being labelled with a certain sequence i (i = 1, …, n) is , given that the same concentration of each label is used. Subsequently, n imaging rounds are performed to record all groups of localizations required to obtain the final RESI image.
The minimum number of labels (n) and rounds necessary to achieve sufficient sparsity of binding sites in each imaging round will depend mainly on three factors: SMLM localization precision and density and the molecular arrangement of the protein of interest. Here we describe how these parameters affect the final RESI results using a few practical examples.
A typical study case is that of single proteins arranged in dimers, which in turn present another specific spatial organization in space. This is the case, for example, of the Nup96 in the NPC. In this case stochastic labelling has to be such that the probability of labelling two proteins forming a dimer with different sequences is sufficiently high. For n rounds of labelling/imaging, the probability is
for n = 4 labelling/imaging rounds P(diff. seq.) ≈ 75%. We chose n = 4 to demonstrate that it provides a relatively high P(diff. seq.) with only a few imaging rounds. We note, however, that n >4可用于增加p（diff。seq。），因此可以最大程度地提高每个回合中标记的结合位点的稀疏性。
要解决一组任意数量的分子，M比DNA-Paint的分辨率更接近，必须用正交序列标记它们。通常，用正交序列标记的M分子的比例，因此可分解的分子集比例遵循方程
这是一个常见的情况，例如，对于膜受体。如果蛋白质是以CSR方式分布的（图14A的扩展数据），则DNA粉刷已经可以解决与其NNS足够间隔的单一蛋白质。我们将考虑距离D = 4×σDNA-PART的蛋白质可靠地解决（请注意，此标准明显比2.35×σDNA-Paint明显更严格）。然后，对于给定的密度，可以计算NND直方图，并计算出d的距离的比例（扩展数据图14b）。这代表了单蛋白F的比例F，而DNA-Paint不会解决。在这里，我们将F绘制为密度和分辨率的函数（扩展数据图14C）。这样的地图已经提供了一种工具来了解以给定密度分解单蛋白所需的SMLM分辨率的水平。
RESI可以在此解释为通过将目标拆分为不同随机标记的子集来降低有效密度的一种方式。因此，根据公式将降低每个回合的有效密度。扩展数据图14D显示了2D MAP的一维切割，以提供选择正交序列数量（因此成像弹）的准则，才能有效地执行RESI。例如，对于20 nm（σ= 5 nm）的初始分辨率，在细胞上下文中是DNA-PART的典型分辨率，并且密度为（相对较高），n = 4个不同的序列足以提供P（diff。seq。）≈90％的D下达D（d下的蛋白）（扩展数据图14D）。然后，这些蛋白质将通过RESI解析。
如Wu等人30所述，对同一核的DNA-Paint和RESI测量进行了NUP96数据的模型平均数据。相应的毕加索HDF5文件在SMAP43中进行了细分，并以兼容的文件格式通过使用插件segmentNPC，npcsementCleanup和siteNumbers2loc来保存。然后，通过运行MATLAB中的erenterFusion.m脚本（可提供SMAP源代码），在带有默认参数的结果_sml.mat文件上执行无模型平均。所示的平均值对应于最终迭代的结果，其中每个点用x，y和z中的σ= 2 nm的高斯呈现。
为了解释未处理细胞中NND数据的结果，进行了数值模拟。简而言之，模拟了两个人群，其中一个CD20单体和一个具有CSR分布的二聚体之一，然后计算出其NNDS。该算法可以总结如下：
单体的参数密度=212μm-2，二聚体的密度=0μM-2，不确定性= 5 nm，标记效率= 50％用于比较RTX处理的细胞的数据与单体CSR分布的数据。
对于未经处理的情况，最佳拟合参数是通过迭代，非线性，最小二乘算法获得的。实验观察到的密度（50分子µM – 2）用于模拟。
对于每组参数，都进行了模拟，NND是直方图的，并计算了模拟和实验直方图之间平方差的总和。拟合包括查找最小化平方差和最小的参数。
注意：frac_of_monomers = 100 - frac_of_dimers
现在可以找到最匹配所提出的模型和数据的参数D_OPT，σ_label_opt和frac_of_dimers_opt。在这种情况下，它导致d_opt = 13.5 nm，σ_label_opt= 5.5 nm，frac_of_dimers_opt = 47％（图4e，f）。
现在获得了参数D_OPT，σ_label_opt和frac_of_dimers_opt的不确定性。
