小鼠BA/F3父母细胞系于2003年从Dana-Farber癌症研究所获得。在RPMI 1940年谷氨酸培养基（Thermofisher，61870-036）中维持了补充10％（v/v）胎牛血清（FBS）（Corning，35-015-CV），2MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM MMM MMM MM SOD，5-60F00-H），10 mM HEPES（Bioconcept，5-31f00-H）和5 ng ML-1重组鼠IL-3（Life Technologies，PMC0035）。衍生的BA/F3 KRAS和NRAS突变体已在IL-3退出中培养。MEL JUSO，IPC298和SKMEL30细胞系来自DMSZ。VMM39，HT-1080，HEP G2，NCI-H358，MIAPACA2，SW1990，A375，NCI-H1437，PANC04.03和CALU-6从ATCC获得。MM485细胞系是从澳大利亚牢房的。UACC-257是从美国国家癌症研究所获得的。KP4细胞系是从Riken细胞库中获得的。PC9细胞系来自Kinki大学医学院基因组生物学系K. Nishio。从Invitrogen获得293英尺。Mel Juso IPC298，SK-MEL-30，MM485，VMM39，CALU-6，UACC-257，NCI-H358，SW1990，PC9，NCI-H1437和PANC04.03和PANC04.03细胞系在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 Medied（RPMI）维持10％（Roshe）（FBS）（Corning，35-015-CV）。HT-1080，MIAPACA2，A375，KP4和293FT细胞系在补充了10％（v/v）FBS（Corning，35-015-CV）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中。HEPG2保持在Eagle的最小必需培养基（EMEM）中，该培养基（EMEM）补充了10％（v/v）FBS（Corning，35-015-CV）。所有细胞系均根据供应商提供的标准说明（DSMZ，澳大利亚Cellbank，ATCC，Invitrogen，Riken和NCI）培养。
表达SHOC2，NRAS非靶向shRNA的稳定线是通过慢病毒感染产生的。首先使用HEK293FT细胞进行慢病毒的产生。将细胞接种在T175细胞培养瓶中，并用12 µg PVPR-GAG-POL，4.8 µg PMD2-VSV-G和1 µg使用Mirus Transit表达SHRNA的慢病毒载体（Mirus，mirus，mir2700）。48小时后，使用0.45 µm注射器过滤器收集含有病毒的上清液并过滤，并随后用于转导癌细胞系。然后，感染后24小时，用紫霉素选择细胞（Sigma，P9620）。
通过将shRNA克隆到Plko-Teton-Puro骨架（Addgene，21915）中，通过使用AGEI或ECORI限制位点将SHRNA DOX诱导的构建体产生。The target sequences for the different shRNAs are shRNA SHOC2-169012 (GCTTGAGTCACCATGAGTAGT), shRNA SHOC2-169009 (CTGACTCTCTTGATAACTTGA), shRNA NRAS (CCATGAGAGACCAATACATGA) and shRNA non-targeting (GGATAATGGTGATTGAGATGG).
用冰冷的PBS冲洗细胞，颗粒并在-80°C中捕获冻结。用裂解缓冲液（1％Triton X-100、50 mm Tris-HCl，pH 7.4、150 mm NaCl，1 mm EDTA）制备整个细胞裂解物4693159001）。
通过在4°C下以13,000 rpm离心20分钟来清除细胞裂解物，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，23225）确定蛋白质浓度。通过添加Laemmli缓冲液（Bio-Rad，1610747）和煮沸5分钟，将样品标准化为蛋白质含量，然后在标准TGX 4-15％预制凝胶（Bio-Rad，5671085）上加载。使用Trans-blot Turbo系统（Bio-Rad，1704150），将蛋白质转移到Trans-blot Trabot Trbo MIDI硝酸纤维素转移膜（Bio-Rad，1704159）中。将所有膜用5％的牛奶（Sigma，70166）封闭，然后与原代抗体孵育过夜。使用融合FX7成像系统（Vilber）对免疫印迹进行成像，并使用其集成的量化软件进行光密度分析。
所有抗体均根据制造商的说明在商业上采购和使用。NRAS抗体购自Calbiochem（参考OP25）。RAS抗体购自ABCAM（AB108602）。SHOC2（53600），磷酸-C-RAF SER259（9421），GFP（2956），Phospho-P44/42 MAPK（ERK1/2），THR202/TYR202/TYR204（4370）（4370），P44/42 MAPK（ERK1/2）（ERK1/2）（9102）（9102），Phospho-Mek-Mek11/2 Ser21/2 22.17（9102）phospho-Akt Thr308 (9275), phospho-Akt Ser473 (9271), phospho-S6 ribosomal protein Ser235/236 (2211), phospho-S6 ribosomal protein Ser240/244 (Ref. 2215), phospho-IGF-I receptor β Tyr1131 (3021), IGF-I receptor β（9750），CAS9 HRP共轭物（97982），HRP链接的小鼠IgG（7076）和HRP连接的兔IgG（7074）抗体购自细胞信号技术。FLAG HRP共轭物（A8592），Vinculin（V9131）和α-微管蛋白（T6199）抗体购自Sigma-Aldrich。
使用RAS激活测定生物化学试剂盒（Cytoskeleton，BK008）确定活性GTP的RAS水平。MEL JUSO和A347细胞用30 µM的化合物6或等效量DMSO处理2 h和4 h。按照制造商的指示裂解细胞。下拉用400 µg的裂解液与30 µL RAF-RBD珠混合，并在4°C下在旋转器上孵育1小时。用2×Laemmli缓冲液洗脱结合的蛋白质，并在蛋白质印迹前在95°C煮沸5分钟。
鼠ba/f3细胞主要用慢病毒cas9构建表达pngx_cmv_flag-cas9转导。通过荧光激活的细胞分选（FACS）和免疫印迹评估Cas9阳性细胞。随后将BA/F3-CAS9细胞稳定地用PCDNA3.1（+）EGFP-T2A-FLAG -KRAS G12C，G12D，Q61R，Q61H或NRAS G12C，G12C，G12D和Q61R。所有BA/F3转染均通过电穿孔完成。对于每次转染，收集了200万个细胞，沉淀并在没有MG2+或Ca2+的PBS中洗涤。然后将洗涤的细胞重悬于每个样品的100 µL缓冲液R中，并分布在每个含有10 µg相关质粒的DNA稀释液中。按照制造商的说明，使用1635 V，20 ms，1脉冲的霓虹灯站设置进行电穿孔。然后将细胞在装满预热介质的六孔板中恢复过夜。然后，在电穿孔后48小时，将培养基替换为含有BA/F3-CAS9的600 µg mL-1新霉素的选择培养基和600 µg mL-1 neomycin和20 µg ml-1 blasticidin的所有kras或NRAS表达突变体。在产生过程中，将细胞保存在5 ng ML-1重组IL-3的情况下。在IL-3撤回后，进行了KRAS-或NRAS表达线的验证，以确保细胞对癌基因表达的依赖性。
In the genome-wide isogenic screen, each of the previously engineered murine Ba/F3 cells expressing Cas9 and a single mutation in either KRAS (G12C, G12D, Q61R or Q61H) or NRAS (G12C, G12D or Q61R), as well as the control line Ba/F3 wt-Cas9, were expanded in the relevant medium and infected with either pool 1 or pool 2 of the全基因组sgrna库（Cellecta McRispr v.1 Pool1和Pool2）38。然后，感染后24小时，在1 µg mL -1紫杉霉素中选择。用KRAS或NRAS突变体转导的CAS9和BA/F3的BA/F3细胞在补充（或耗尽）的培养基中，用重组鼠IL-3传递。接下来，感染后14天，将存活的细胞接受样品收集（重复）和基因组DNA制备，以进行深层测序。使用Bowtie39对原始测序读数进行对齐，而无需不匹配并产生计数。使用DESEQ2软件包40计算差异SGRNA表示。对于基于基因的HIT呼叫，SGRNA通过稳健的Z分数对SGRNA进行排名，并且使用冗余siRNA活性（RSA）算法计算了每个基因富含更高等级（RSA UP）和较低等级（RSA向下）的统计显着性。
先前设计的鼠BA/F3细胞系在KRAS（G12C，G12D，Q61R或Q61H或Q61H）或NRA（G12C，G12D或Q61R）中表达CAS9和单个突变，并用非靶向/对照sgrna感染了sgrna（5''CRISPR RNA Shecgn or shocgn or shocgn or shocgn of（5'CRISPR RNA序列：caggccaaggcgatttaaac）。在选择抗生素一天后，将细胞在生长培养基中的96孔板中播种。根据制造商的说明，通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定法（Promega，G7572）进行了两天后，对细胞的生存能力进行了评估。
为了评估DEPMAP中的筛选命中，从DEPMAP门户（https://depmap.org/portal/）下载了第22q2版的CERES分数，每个基因的平均得分是在G12中带有差异的细胞系之间的平均分数，而HRAS，KRAS和NRAS的Q61残基中有差异。使用Benjamini – Hochberg方法校正了对多次测试进行校正的t检验计算统计数据。
将细胞接种在六孔板中，并在生长培养基中连续一夜之间连接。然后将它们用100 ng ml -1强力霉素盐酸盐（Fisher Bioreagent，BP26535）处理10-15 d。在测定过程中，用强力霉素每三天更新细胞培养基。随后，用20％戊二醛固定细胞10分钟，用水洗涤并用晶体紫罗兰色染色30分钟。然后用水洗涤细胞，干燥并扫描。然后将晶体紫溶解在10％乙酸酸性中15分钟。将溶液在乙酸酸性中稀释1：4，并以一式三份转移到96孔板中进行定量。使用板读取器（Bertholdtech Mithras）以590 nm的波长读取吸光度。
将细胞在康宁（384孔板，透明圆底底部，3830）中的超级附着的微层中种子（六倍），在包含10％FC的生长培养基中，然后在200G处离心3分钟，并允许形成球体或聚集体24小时。然后，用30 µM的化合物6或DMSO处理细胞，并在Incucyte SX5 Live细胞分析系统（Satorius，Essen Bioscience）中转移，该系统放置在37°C的常规组织培养孵化器内，使用5％CO2。每六个小时以×10的放大倍数对聚集体或球体进行一次成像，持续三周。在整个测定过程中，含有DMSO或化合物的生长培养基每周两次更新。使用incucyte球体分析软件模块（Sartorius，Essen Bioscience，9600-0019）分析图像，其中创建了虚拟口罩来描述球体。每个时间点的每个球体的面积都是生成的。从球体区域（半径=√（区域/π）；体积= 4/3×π×半径3）计算出球体的半径和体积。将体积数据标准化为每个球体的初始体积。
根据制造商的说明，使用Qiagen rneasy试剂盒（Qiagen，74104）从细胞中提取总RNA。使用QuantStudio 6实时PCR系统（Applied Biosystems）上的QuantItec PCR Mastermix多路复用（Qiagen，204643）进行定量PCR（QPCR）分析。每个QPCR反应一式三份进行，使用每个反应10 ng RNA。使用2 -ΔΔCT方法分析结果，并用肌动蛋白B进行标准化。所有特定的QPCR引物均从Invitrogen（Taqman Assay）购买：SHOC2（HS00201309_M1），NRAS（HS00180035_M1），SPRY4（HS00180035_M1），SPRY4（HS002229610_M1），EGM1，EGFR1（HS001）DUSP5（HS00244839_M1）和DUSP6（HS01044001_M1）。
使用Qiagen rneasy minikit提取细胞系或肿瘤的总RNA。使用Novaseq 6000平台（2×101基对读数）进行测序。对于IPC-298单元线，使用了Illumina NovaseQ控制软件v.1.6.0，RTA V.3.4.4，BCL2FASTQ V.2.2.20.0.0.422和FASTQC V.0.11.7。对于MEL JUSO细胞系，使用了Illumina NovaseQ控制软件v.1.8.1，RTA v.3.4.4，Bcl2fastq v.2.2.2.20.0.0.422和FastQC V.0.11.9。使用PISCES v.2018.04.112进行了转录对准和定量，并参考了HG38人类基因组。使用DESEQ2（参考文献40）进行差异表达分析。在IPC-298细胞系中，对于四个shRNA中的每一个（两个靶向shoc2，一个靶向NRA的shRNA和一个非靶向shRNA），多西环素治疗与没有强力霉素对比。使用符号p值（符号（log2（fc））×–log10（p-value））作为等级，对每种对比度进行了预先排名的基因富集分析。测试的基因集是从分子特征数据库（MSIGDB）获得的。测试了以下途径的富集：MEK_UP.V1_UP，KRAS_SIGNALING_DN，EGFR_UP.V1_UP，KEGG_CELL_CYCLE，HALLMARK_APOPTOSIS和HALLMARK_G2M和FDR校正后的P-Values。在MEL JUSO细胞系中，在4 h和24小时时，在4 h和24小时时，在4 h和24 h时进行化合物处理6和7的差异表达分析使用R包装EDGER进行。每个化合物×时间×浓度组与匹配的对照组对比。如上所述，在所有标志途径上所述计算了基因元素富集，并计算了对p值的FDR校正。使用R v.4.1.0使用r软件包FGSEA V.1.18.0，GGPLOT2 V.3.3.6，Cowplot V.1.1.1和GGPUBR V.0.4.0创建了数字和FGSEA分析。
异种移植研究是在诺华进行的，并严格遵守诺华生物医学研究动物护理和使用委员会方案和法规。研究得到了瑞士巴塞尔·史塔特（basel Stadt）的庞大兽医办公室的批准，并严格遵守《瑞士联邦动物福利法》和法令。将小鼠保存在最佳的卫生条件下，在12 h的笼子中，在12 h：12小时的黑暗中：光条件和受控温度（20–24°C）和湿度（45-65％），并获得了消毒的食物和供水。Subcutaneous tumours were induced by injecting cells in HBSS containing 50% BD matrigel in the flank of female athymic Crl:NU(NCr)-Foxn1nu-homozygous nude mice (Charles River; MugMel2_shNT, MugMel2_shNRAS, MugMel2_shSHOC2, 6 × 106) or female and maleC.B-1B/ICRTAC-PRKDCSCID小鼠（Taconic; IPC298_SHNT，IPC298_SHNRAS，IPC298_SHSHOC2（169009）和IPC298_SHSHOC2（169012）（169012）; 10×106）。为了诱导ShRNA KD，动物每天接受强力霉素治疗（Sigma Aldrich;每天一次，口服一次25 mg kg-1），或者用多西环素尖刺的食物（Sigma Aldrich; Sigma Aldrich; 625 mg饮食）喂食。对于功效研究，当平均肿瘤大小达到200-300 mm3时，开始强力霉素治疗。每周两次通过卡尺测量肿瘤大小，每周两次记录体重。使用公式（长度×width2）×π/6 mm3计算肿瘤大小。数据表示为平均值±S.E.M.治疗2-3周后，在相关时间点杀死动物。收集用于生物标志物分析的肿瘤样品，在液氮中冷冻，并在-80°C中冷冻，直到进一步加工。
将编码不同RAS变体的G结构域（氨基酸1-169）的DNA序列插入质粒中，该质粒允许在T7启动子控制下在大肠杆菌中蛋白质表达。对于生物素化蛋白，在存在1 mM生物素的情况下，BIRA连接酶与感兴趣的基因共表达。表达由0.5 mM IPTG诱导，并在18°C过夜进行表达。将细菌颗粒重悬于裂解缓冲液中（20 mM Tris pH 8.0，500 mM NaCl，5 mM咪唑，2 mM TCEP，10％甘油，完整的蛋白酶抑制剂（ROCHE）和40 U ML -1 -1 UML -1 turn -1 turn -1 turncolease（Sigma（Sigma））。用高压均质剂（Avestin Emulsiflex C3）裂解细胞，并在40,000g下在4°C下以40,000g的超速离心来阐明裂解物。将澄清的裂解物加载到Ni-Sepharose HP（Cytiva）上。洗涤珠，并用iMac缓冲液（20 mM Tris pH 8.0，500 mM NaCl，2 mM TCEP和10％甘油）中的5–200 mM咪唑梯度洗脱蛋白质。将洗脱蛋白的融合标签通过His标记的HRV 3C或TEV蛋白酶在4°C下裂解过夜。将切割的蛋白重新加载到Ni-NTA树脂（反向IMAC步骤）上，并收集含有靶蛋白的流通液。该蛋白质用10 kDa MWCO超滤系统（Millipore）浓缩，并加载在HiloAD 16/600 SuperDex 75 PG尺寸 - 分类柱上，并用SEC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，5 mm NaCl，5 mm MgCl2和2 mM MM tce）预取上。合并了含有感兴趣蛋白质的分数，浓缩了10 kDa的分子量截止性超滤系统，并冷冻。核苷酸交换是通过在25 mM EDTA的情况下在室温下与24倍摩尔过量的核苷酸（GMPPNP（Jena Bioscience）或GDP（Sigma））在室温下孵育24倍的RAS蛋白。然后使用PD-10色谱柱（Cytiva）对核苷酸载荷缓冲液（40 mM Tris pH 8.0，200 mm（NH4）2SO4和0.1 mM ZnCl2）交换混合物缓冲液。。再次加入新鲜的24倍摩尔过量的核苷酸。然后，将10 U的虾碱性磷酸酶（新英格兰Biolabs）添加到包含GMP = PNP的样品中。在4°C下孵育1小时后，将MGCL2添加至30 mm的浓度。
编码不同SHOC2变体的DNA序列（对于AVI标记的SHOC2氨基酸93-582；对于His标记的SHOC2 FL和G290A）插入质粒中，从Invitrogen获得了BACTO-BAC系统，从而使重组Baculovirus产生了重组的Baculovirus。将病毒添加到SF21昆虫细胞后，在27°C的96小时内进行表达。对于生物素化蛋白，在存在1 mM生物素的情况下，BIRA连接酶与感兴趣的基因共表达。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液中（50 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，20 mM咪唑，10％甘油，0.2％Triton X-100，完整的蛋白酶抑制剂（ROCHE）和40 U ML-1 turn-1 turn-1 turn核酸酶（Sigma））。通过超声处理裂解细胞，并在40,000g下在4°C下以40,000g的超速离心阐明裂解物。将澄清的提取物加载在Histrap HP 5 mL柱（Cytiva）上。将色谱柱洗涤，并用iMac缓冲液（50 mm Tris pH 8.0、300 mM NaCl和10％甘油）中的20–300 mM咪唑梯度洗脱蛋白质。将洗脱蛋白透析透析透析透析缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，0.1 mM TCEP和10％甘油），并在4°C下通过HIS标记的HRV 3C蛋白酶在4°C裂解过夜。将切割的蛋白质重新加载在Histrap柱（反向IMAC步骤）上，并收集含有靶蛋白的流通液。将蛋白质用30 kDa MWCO超滤系统（Millipore）浓缩，并加载在用SEC缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，150 mm NaCl，Nacl，1 mm TCEP和10％甘油中）预取平衡的SuperDex 200 Pg尺寸 - 排斥柱（Cytiva）。合并了含有感兴趣蛋白质的分数，使用超滤系统浓缩并捕获冷冻。对于需要多齐二氨酸标签的测定，准备蛋白质样品，以省略HRV 3C裂解和反向IMAC步骤。
坐式蒸气 - 扩散方法用于所有Shoc2复合物的结晶。SHOC2 – NRAS Q61R共复合晶体是通过将NRAS Q61R（1-168）和SHOC2（80-582）混合以1：1.2摩尔比以15 mg ml-1的最终浓度获得的。将蛋白质混合物溶液与0.2 µL井溶液（0.1 M HEPES pH 7和15％PEG 4000）混合，并在室温下孵育。使用结晶溶液冷冻保护晶体，并添加20％甘油，然后直接将晶体冻结到液氮中。通过先在14 mg ML -1 Shoc2的最终浓度下以1：1.5的比例孵育Shoc2 80-582，并以1：1.5的比例获得SHOC2肽晶体。接下来，将50毫米DMSO中的肽与储存缓冲液中的蛋白质溶液混合在一起，导致蛋白质 - 配体溶液中0.65％DMSO。将该溶液混合，短暂孵育，然后将1：1与井溶液（0.05 M HEPES pH 7.5，35％V/V五氯硫醇丙醇丙醇5/4 PO/OH（PP 5/4 PO/OH）和0.2 m KCl）和4°C孵育。通过在0.65％DMSO中将2 µL补充了20％甘油和325 µM肽添加2 µL的井溶液，从而将晶体冷冻保护。然后收集晶体并在液氮中闪烁。
为了产生用于微种子的高质量晶体的最大量，我们手动完善了生产Shoc2-肽晶体的原始条件。A gradient of pH/buffering agent versus PP 5/4 PO/OH concentration (15–40% v/v PP 5/4 PO/OH; pH range of 5.5–9 with 50 mM Bis-Tris pH 5.5, 50 mM Bis-Tris pH 6.0, 50 mM HEPES pH 6.5, 50 mM Tris-HCl pH 7.0, 50 mM HEPES pH 7.5, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM HEPES pH在24孔板中，将8.5和50 mM的pH 9.0）设置为2 µL下降的蛋白质和配体条件相同。一种条件（50 mM Tris pH 7.0、200 mM KCl和40％PP 5/4 PO/OH）导致许多大晶体。为了生产Apo Shoc2（氨基酸80-582）的微种子，我们首先确认具有新条件的晶体在同一空间组中衍射，通过收集两个晶体而没有进一步的冷冻保护并以相同的方式收集数据，以与原始结构相同。通过在2 µL滴上添加10 µL的井溶液，收集了其中许多这些晶体的井来进行微种子。在与移液器温和混合后，将溶液吸入含有种子珠的微管（Hampton Research，HR2-320）。接下来，使用40μl井溶液进一步稀释同一管中的溶液。按照制造商的说明，将管子涡流3分钟以破坏晶体。然后，添加450 µL的井溶液以进一步稀释微丝网。使用井溶液生产了该股票的连续稀释液（1：10，1：100和1：1,000），并将每个稀释度用作井溶液，并在24孔板中与SHOC2 80-582（14 mg ml-1）的汤料混合1：1。种子储备的多种稀释液产生了可用的晶体，并选择了1：1,000以进行收集，而无需进一步的冷冻保护。数据收集和分子替代使用相同的工作流程揭示了APO SHOC2结构，其中一个与Shoc2肽结构相似的非对称单元中的Shoc2副本（数据未显示）。由于P212121空间组中的晶体接触为SHOC2结合位点的配体结合提供了更多的空间，因此我们将（R）-5的溶液浸入了这些SHOC2 APO晶体中，以获得合适的数据集。
使用配备QCI冷冻探针的600 MHz Bruker Avance NEO在310 K的温度下获取了所有光谱。在50 mM磷酸钠pH 7.0和11.1μMDSS中以35μm的蛋白质浓度以11.1μMDSS获取13C甲基甲基甲基标记的Shoc2（80-582）的SOFAST-HMQC42光谱（80-582）。使用NMRPipe43处理数据：
通过非线性最小二乘形式（δFree）（ΔFree）和配体结合形式（ΔFree）和配体结合形式（δobs）在多个配体浓度下，通过非线性最小二乘拟合（ΔδOBSHz）的非线性最小二乘拟合估算了化合物1与SHOC2（80-582）结合的分离常数。使用以下关系：
其中ΔΔmax是一个拟合参数，对应于Δfree -Δbound，ΔBound是完全结合态的估计移位（Hz），PT是总蛋白质浓度，而LT是总配体浓度。
M173和M219的共振分配是通过诱变进行的。将M173突变为ALA，并将M219突变为ALA。SHOC2的同位素标记是通过在向ESF921 Delta系列甲硫酸甲硫酸甲基甲米甲米（Clm-206-1）中添加1 g L-1-甲基酮（甲基-13c）（剑桥同位素实验室，CLM-206-1）实现。在ESF921中，SF21细胞的密度为每毫升8×106细胞（表达系统，96-001-01）。然后，通过添加补充1 g L-1-甲基二氨酸（甲基-13C）的无菌ESF921DELTA系列缺陷培养基，将这些细胞稀释至每毫升0.8×106细胞的密度，并生长3-4 d，直到达到每毫升8×106细胞的密度。使用ESF921DELTA系列缺陷型培养基，将细胞再次稀释至每毫升0.8×106细胞的密度。On the day before infection, cells were diluted to a density of 1.0 × 106 cells per ml into a final volume of 6 l of ESF921Delta Series methionine-deficient medium supplemented with 1 g l−1 -methionine (methyl-13C) (split between two 5-l shaker flasks) and allowed to grow to a density of 1.7 × 106 to 1.8 × 106 cells per ml (18–24 h).然后每升培养物用10 mL P2病毒感染细胞；然后，蛋白质表达在27°C下进行3 d。按照所述未标记的SHOC2（80–582）纯化每个样品。对于NMR实验，将蛋白质凝胶过滤成50 mM磷酸钠pH 7.0、100 mM NaCl，1 mM TCEP和10％D2O，并以最终蛋白质浓度为35 µm。然后将每个突变体的sofast-HMQC与野生型Shoc2（80-582）的光谱进行比较，以确定每个甲氨酸的分配。
如先前所述，进行沉积 - 速度实验进行了10。简而言之，将样品透析到分析性超离心缓冲液中（20 mm Bis-Tris pH 6.5，500 mm NaCl，0.5 mm MGCL2，1 mm TCEP和5 µM GMP-PNP），加载到双扇形中心零件中，然后将其置于1.2 cm的中心和sapphire Winders和Sapphire Winders和Sapphire的双层中心，然后将在42,000 rpm的高速沉积开始之前，平衡至20°C 2小时。用C（S）分析41（Sedfit v.5.01b）检查了在280 nm处收集的数据。使用GUSSI44可视化C（s）图的形式。
将C端AVI标签和生物素化的SHOC2（80-582）和全长SHOC2固定在链霉亲和素涂层的感觉赛（Cytiva，BR-1005-31）上。为了固定，将1 µg mL-1 Shoc2-AVI注入10 µl min-1的流速在22°C芯片温度下，在50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM NaCl，1 mM TCEP和0.1％Tween20中注入10分钟。使用固定缓冲液进行传感器芯片平衡，直到达到稳定的基线水平。固定后，对50 µM生物素溶液（60 s的50 µl min -1）注射以减少非特异性结合。运行缓冲液为50 mm HEPES pH 7.5、150 mm NaCl，1 mM TCEP，0.1％Tween20和2％DMSO。使用50 µL min -1（接触时间60 s和解离时间90 s）在22°C下进行实验。以12个浓度为1：2.5的化合物系列的化合物评估化合物。通过在100％DMSO中稀释化合物来制备库存化合物剂量反应。从DMSO库存稀释系列中，在没有DMSO（1:50）的运行缓冲液中进行稀释到最终浓度并注入。DMSO溶剂校正用于校正大量效应。每次运行中都包括对内部鉴定的低分子量粘合剂的连续稀释，以确认实验之间的灵敏度。同样，在测试化合物之间注入了固定浓度，以评估整个运行过程中信号的稳定性。所有SPR分析均在Biacore 8K仪器上进行。使用Biacore Insight评估软件V.4.0.8.20368处理数据。原始数据是双重引用的，即，对参考流单元的响应校正了测量流单元的响应，在第二步中，减去了空白注入的响应。如有必要，将删除离群传感器。通过应用1：1结合模型来计算动力学速率常数和平衡解离常数，从而拟合传感器。Rmax设定在Global， 而RI设置为恒定（如果需要的（如果需要），则在全球范围内安装）。每次运行单独处理数据。生成的值用于计算结合常数的平均值和标准偏差。
配体亲和力通过SPR使用BIACORE 8K设备（GE Healthcare）确定。将C末端AVI标签和生物素化的RAS构建体固定在链霉亲和素涂层的传感器上（Cytiva，BR-1005-31）。对于固定化，将0.04 µg ml-1 ras-AVI注入10 µl min-1的流速在22°C的芯片温度下，在50 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl，1 mmMMMGCL2，MGCL2，10 µm核苷酸状态（GMP-PNP，GMP-PNP，GDP，GDP，GDP，GTP，GTP，copting contection contection contects）评估），1 mM TCEP和0.1％Tween20。使用固定缓冲液进行传感器芯片平衡，直到达到稳定的基线水平。固定后，对50 µM生物素溶液（50 µL min -1，60 s）进行了一项注入，以减少非特异性结合。运行缓冲区与固定缓冲液相同。使用25 µL min -1的流速在22°C下进行实验（接触时间60 s，解离时间250 s）。未标记的重组SHOC2（80–582）或全长SHOC2在1：2.5的连续稀释系列中测试，最大浓度为25 µm，在运行缓冲液中制备。所有SPR分析均在Biacore 8K仪器上进行。使用Biacore Insight评估软件V.4.0.8.20368处理数据。原始数据是双重引用的，即，对参考流单元的响应校正了测量流单元的响应，在第二步中，减去空白注入的响应。如有必要，将删除离群传感器。通过应用1：1结合模型来计算动力学速率常数和平衡解离常数，从而拟合传感器。RMAX设置在Global，而RI则设置为恒定。每次运行单独处理数据。生成的值用于计算相应结合常数的平均值和标准偏差。在同一运行中，只有一个加载状态（GDP，GMP-PNP或GTP） 评估并在固定/运行缓冲液中补充了各自的核苷酸。
检测并使用基于敏感的TR-FRET的竞争性结合测定法与Europium标记的抗HIS抗体（EU-AHISAB，Lance EU W1024抗6×perkinelemmer）和Cy5-s cy5-saugectavectavectave（Eu-ahisab），使用基于敏感的TR-Fret的竞争性结合测定法检测并定量蛋白质 - 重大相互作用，并使用敏感的TR-Fret竞争性结合测定（eu-ahisab）（Eu-lance EU W1024抗6×perkinelmer）和cy5-s cy5-saugectav，检测到了与NRAS Q61R：GTP的结合并定量医疗保健/Amersham，PA45001）。N-末端HIS标签的重组人类全长SHOC2（氨基酸1-582）与EU-Ahisab的单独预育，以及C-末端AVI标记的生物素化重组重组的重组人NRAS Q61R：GTP（GTP）（氨基酸1-169）与CY5-SA一起使用30分钟。将测试化合物溶解在100％DMSO中，并通过TTP LabTech蚊子或Labcyte Echo555555移液器添加到包含全长Shoc2/eu-Ahisab的溶液中。孵育60分钟后，使用Fritz Gyger Ag Certus Posettor添加NRASQ61R：GTP/CY5-SA溶液。再孵育60分钟后，使用配备有双波长检测的Pherastar FSX（BMG LabTech，德国BMG LabTech，德国BMG LabTech）微滴定板读取器（BMG LabTech）测量测定板（337 nm的Europium激发，在620 nm处发射Europium发射，在665 nm处发射Europium发射）。最终测定浓度是：10 nm His-Shoc2全长，50 nm NRASQ61R：GTP-AVI，0.25 nm EU-AHISAB和12.5 nm CY5-SA。在化合物浓度期间，单个浓度的高通量筛选的最终化合物浓度为31.25 µm，高达300 µm，导致高通量筛选的最终浓度为0.9％DMSO，化合物表征分别为3％。在包含50 mM HEPES，50 mM NaCl，1 mM MGCL2、50 µM GTP，0.5 mM TCEP，0.005％（w/v）Tween-20-20-20-20和0.005％（W/V）BSA的BSA，调整为pH 7.0的测定缓冲液中进行了预孵育和以下测量。所有溶液均在室温（22°C）下处理。
EC50值是根据蛋白质饱和度百分比与测试化合物浓度的图，根据以下物流拟合的图：
其中y是测试化合物浓度的百分比饱和值，x。A1是最低的饱和值（0％），A2是最大饱和值（100％）。指数P是山系数。
为了确认使用抗性突变体Shoc2（G290A）的Shoc2和Ras之间的破坏的特异性。该协议遵循与上述相同的过程，使用HIS标签的全长SHOC2（G290A）和NRAS（Q61R）：GTP。测定缓冲液与Shoc2-NRA（Q61R）TR-FRET分析中使用的缓冲液相同。最终浓度为5 nm SHOC2（G290A），20 nm NRAS（Q61R），0.25 nm EU-AHISAB，5 nm Cy5-SA和3％DMSO。由于SHOC2突变体的TR-FRET使用SPR确定的KD低于KD的蛋白质浓度（图4C），但尽管突变体Shoc2蛋白的亲和力比RAS比RAS更高，但对于评估位移的评估仍然很敏感。未标记的野生型Shoc2位移也证明了这一点，从而在具有野生型Shoc2和Shoc2（G290A）的TR-FRET中产生了相似的IC50（图4D）。
将SHOC2在含有50 mM HEPES PH7.5、1 mM TCEP，150 mM NaCl和10×Sypro Orange（Invitrogen（Invitrogen）（Invitrogen）（库存5000×）的反应缓冲液中稀释SHOC2。评估每种蛋白质的一式三份井。孵育30分钟后，使用Opus QPCR热循环仪（Biorad）进行DSF测量，渐次升高为0.5°C min-1。使用Biorad分析软件对熔融温度进行评估。
使用编码10-Mer至14-Mer硫醚环化肽的内部mRNA文库进行了两个独立的mRNA显示选择。45,46,47。肽库的编码区域的设计如下。5'引发剂AUG密码子编码为N末端氯乙酰化氨基酸，然后是8-12个完全随机的位置，其中包括三聚体寡核苷酸混合物。三聚体寡核苷酸池除了Met和Cys外，每个氨基酸都包含一个不同的密码子。退化区域之后是针对C末端CYS的TGT编码，从而实现了环化。在3'端，有一个序列编码固定的间隔肽序列（GSGGSG），然后是琥珀终止密码子（TAG）。如前所述46,47，通过挠性介导的遗传代码重编程对体外翻译系统进行了重编程。简而言之，使用n-氯乙酰基-PHE代替蛋白酶。将此重编程的翻译系统应用于mRNA模板，提供了一个10到14-氨基酸硫代硫醚连接的大环肽库，每个肽含有C末端Gly-Ser-Ser链接器。从含有少于1013个唯一环状肽的初始回合开始，使用SHOC2（93-582）的富含亮氨酸的重复域（93-582）富含Shoc2特异性粘合剂，并具有固定在链霉亲蛋白结合的磁性磁珠上的生物素化的C端AVI-TAG。仅使用链霉亲和素偶联的磁珠去除非特异性粘合剂，并通过更长的孵化时间和/或洗涤步骤在后一轮中增加结合严格度。用低（150 mm NaCl）或高（300 mM NaCl）盐浓度进行两个平行的选择周期。通过这种方式，在体外翻译和逆转录后，将样品通过小型脱盐柱进行缓冲交换。将所有选择回合提交给NGS以获得富集的肽序列。以下分析， 选择了大约十个不同的序列以进行化学合成，但是仅在较高的盐浓度（300 mM NaCl）的平盘中发现肽4，并显示出所有序列的约2％的富集，在第6轮中最大值，然后在应用更严重的洗涤过程之前。
HEK 293T细胞用于生成SHOC2 -NRA（Q61K）mut Nanobit，是从ATCC或DMSZ获得的，是Novartis Cancer Cell系列百科全书（CCLE）的一部分，如前所述48验证。在补充有1％稳定 - 谷氨酰胺（Bioconcept，5-10K50-H），1％钠conceptruvate（Bioconcept，5-60F00-H）和10％热量FC的DMEM生长培养基（GIBCO，DMEM高葡萄糖4.5 G L-1，1-26F01-I）中培养细胞。通过对以下SMBIT/LGBIT组合进行标准限制稀释程序进行稳定转染，并分离细胞的单克隆种群：SHOC2 – SMBIT全长/LGBIT/LGBIT-NRAS（Q61K）全长，全长，SMBIT融合到LGBIT与128-氨基酸链接的LGBIT融合，以评估对控制量的128-Amino链接。LGBIT-NRAS（Q61K）表达水平通过蛋白质印迹使用抗LGBIT抗体（Promega，N7100）确定。使用抗SHOC2抗体（细胞信号技术，53600）通过蛋白质印迹确定Shoc2-Smbit水平。
复合储备溶液是由Novartis Pharma Ag的化合物中心在DMSO/H2O（90:10）中制备的。用七点或八点串行稀释1：3测试化合物，起始浓度为30 µm。
在DMEM生长培养基中培养了使用Nanobit Technology49在细胞中评估细胞中蛋白质 - 蛋白质相互作用49，HEK 293T SHOC2 – SMBIT – LGBIT-NRA（Q61K），HEK 293T SMBIT-128-氨基酸– LGBIT细胞在DMEM生长培养基中培养。通过在各自的培养基中离心通过离心传递细胞，并以1:20的比例分为新培养基。在基于纳米细胞的免疫测定法之前，将20,000个细胞接种在100 µL的完整生长培养基中，并补充了96孔板的每孔0.1％FCS（Thermo Fisher 96孔，平底微孔板，136102）。将板在37°C和5％CO2下孵育2小时。孵育后，使用HP300分配器以增加浓度的化合物，七点串行稀释1：3从30 µm到40 nm作为最低浓度开始处理4 h。孵育后，将培养基替换为60 µL带红色苯酚红色（Gibco，11058）的Opti-Mem，在Opti-Mem W/O W/O phenol Red中稀释了1:60，添加了15 µL纳米live Live底物（Promega，n2012）。将板在轨道振荡器上混合5分钟，并在室温下再孵育10分钟。使用Pherastar FSX（BMG LabTech）进行发光信号强度的检测。使用标准的Novartis内部测定数据分析软件（Helios软件应用，Novartis Institutes for BioMedical Research，未发表）分析了绝对合格的AC50值，使用所述的方法为50,51,51,52,53,54。关于SHOC2（G290A）突变体的实验，将HEK 293T细胞以每个井的密度为20,000个细胞将96孔板铺板，并在37°C和5％CO2下孵育过夜。在接下来的几天中，将细胞用Shoc2（Gly290） - Ala-Smbit和LGBIT-NRA（Q61K）转染，并在37°C和5％CO2中再次孵育过夜。使用HP300分配器以增加浓度的化合物，七点系列稀释1：3从10 µm到40 nm作为最低浓度开始4小时，对细胞进行处理。孵育后，25 µl纳米lo活实子底物 （Promega，n2012）添加了稀释的1:60，在没有苯酚红的Opti-Mem中稀释。将板在轨道振荡器上混合5分钟，并在室温下再孵育10分钟。使用Pherastar FSX（BMG LabTech）进行发光信号强度的检测。
除非另有说明，否则所有商业可用的化学品和溶剂均被视为接受。肽合成和净化的溶剂为高性液相色谱（HPLC）等级。化学物质购自Sigma Aldrich，VWR或Emolecules。
使用Waters Accipity UPLC进行了分析性超高液体染料 - 质谱法（UPLC-MS）。方法A：柱，Cortecs C18，2.7 µm，2.1×50 mm在80°C下；洗脱液A，水+0.05％HCOOH+3.75 mm NH4OAC;精灵B，异丙醇+0.05％HCOOH；梯度，1.4分钟内为5–50％B，0.3分钟内50–98％；流量为1.0 mL min -1。方法B：Waters UPLC的生存；柱，beh c18，1.7 µm，2.1×100 mm在80°C下；洗脱液A，水+0.05％HCOOH+3.75 mm NH4OAC;精灵B，异丙醇+0.05％HCOOH；梯度，8.4分钟内为5–60％B，1.0分钟内60–98％；流量为0.4 ml min -1。方法C：系统耦合到XEVO G2-S QTOF MS（ESI）;柱，Accarity UPLC CSH C18，1.7 µm，2.1×100 mm在80°C下；流量为0.5 ml min -1;洗脱液A，水+0.05％TFA；精灵B，MECN+0.04％TFA；梯度，在9.2分钟内保持5％的0.2分钟，5-98％B。使用DAD-UV色谱图在210 nm处检测到峰，并通过电喷雾质谱（±模式）鉴定化合物。
使用预先包装的硅胶盒，具有指示的流动相；或在反相制备中HPLC酸性方法：仪器，BüchiPure 835；柱，水域Xbridge C18，OBD准备柱，30×250毫米；流量为40 mL min -1;或水XSELECt CSH C18 OBD，30×100毫米；流量为30 ml min -1，5 µm粒径；检测器，UV（220/254/280/320 nm）+ELSD;流动相，0.1％TFA+乙腈水性；梯度，较低的乙腈比例为2分钟，从较低到更高的乙腈比例为15分钟，3.5分钟至较高的乙腈比例；室温下的圆柱；或逆相制备HPLC非酸性方法：仪器，水自动化系统；柱，Waters Xbridge C18，OBD准备柱，30×150毫米；流量为50 ml min -1，5 µm粒径；检测器，水域2489 UV/可见检测器；流动相，0.08％水氢碳酸氢铵+乙腈；梯度，在5％乙腈时1分钟，11分钟5–80％乙腈，100％乙腈在14分钟；室温下的列。
制备性手性HPLC方法：仪器，Shimadzu4；柱，daicel chiralpak ic，250×4.6毫米，粒径为5 µm；检测器，紫外线（220/280 nm）；流动阶段，等项项二氯甲烷-EtoH（75:15:10）+0.05％（25％NH3水溶液）；流量为1 ml min -1;柱温度，25°C。
制备性手性超临界流体色谱法（SFC）方法：仪器，ACCQPREP SFC；圆柱，daicel chiralpak广告柱，250×30毫米，粒径为5 µm；检测器，紫外线（210/254 nm）;移动阶段；洗脱液A，SC-CO2，ERUENT B，ETOH+0.05％（25％NH3水溶液）；等级洗脱，45％b;流量为95 ml min -1;柱温度为40°C；压力，100 bar。
分析性手性SFC方法：仪器，Shimadzu LC-30-ADSF；圆柱，daiCel，如所示，100×4.6毫米，粒径为5 µm；检测器，二极管阵列；流动阶段，练习A，SC-CO2；精疲力尽B，如所示；流量为3 ml min -1;柱温度为40°C；压力，122.5 bar。
1H and 13C NMR were measured on various Bruker Avance spectrometers at room temperature, and data were reported as follows: chemical shift (ppm) from an internal standard, multiplicity (s, singlet; d, doublet; dd, double doublet; ddd, double doublet of doublet; dt, doublet of triplet; m, multiplet; and brs, broad singlet), coupling constant J (Hz), and一体化。
通过在ACN中以1 mg ml-1的浓度溶解样品来进行LC-HRMS分析：H2O（7：3）。使用配备有电喷雾电离源的Orbitrap Lumos（Thermo Fisher Scientific）质谱仪记录LC/ESI-MS数据，并与配备有二极管阵列探测器的Thermo Ultimate 3000液相色谱仪耦合。使用Acerity UPLC BEH C18 1.7 µM，1.0×50 mm的柱实现色谱分离。通过在质量分辨率约为70,000或120,000的质量分辨率（最大宽度最大）的质量分辨率下平均6扫描获得准确的质量。已经发现系统的质量准确性优于2 ppm。色谱法以150 µl min -1的流速进行，梯度为5–100％B乙腈，在9分钟内用0.05％的甲酸进行色谱。流动期A是甲酸0.04％的水。
diad，二异丙基苯二羧酸盐；dic，n，n'-二丙基碳二酰亚胺；DIPEA，N，N-二异丙甲胺；DMF，二甲基甲酰胺；Dodt，2,2' - （乙基乙基）Diethanthiol；Etoac，乙酸乙酯；lihmds，六甲基二硫代酰锂；MECN，乙腈；NMP，N-甲基吡咯烷酮；PD-C，活性炭钯；Pd（DBPF）Cl2，1,1'-双（Di-TERT叔丁基磷酸） - 二氯化二氯化二氯化物；Pd（DPPF）Cl2，1,1'-双（二苯基磷酸） - 二苯基钯（II）二氯化剂；RT，保留时间；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；TIS，三异丙基硅烷。
tert-丁基（S） - （5-溴-2,3-二氢苯并呋喃-3-基）氨基甲酸酯（如参考文献55; 503 mg，1.60 mmol），4,4,4,4'，4'，4'，5,5,5,5'，5,5,5'，5'-octamethyl-2,2'-bi（1,3,3,3,2,3,2,3,2,3,3,3,3,3,3,22（488 mg，1.92 mmol; CAS，73183-34-3）和乙酸钾（472 mg，4.81 mmol）在二恶烷（15 mL）中加入氩气下的PD（DPPF）CL2（DPPF）CL2（77 mg，0.105 mmol）。将反应混合物密封并在90°C下搅拌18.5 h。将反应混合物冷却至室温，并用ETOAC（80 mL）和盐水（30 mL）稀释。用盐水（30 mL）洗涤有机层，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常闪光色谱法（24 g硅胶，环己烷/etoAc 0％至25％）纯化粗残留物，以在纯净分数蒸发后给出，并在真空490 mg（83％的产量）下干燥。（s） - （5-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二甲苯 - 二甲苯烷-2-基）-2,3-二氢苯并苯并呋喃-3-基）氨基甲酸酯（1A，补充图1A）作为固体固体（一种固体固体）（98％pure; rt 1.39 min; rt 1.39 min; rt 1.39 min; rt; rt; ms; msi; msi+zi+s++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++sa）。
To a solution of tert-butyl 2-(2-((3-bromobenzyl)oxy)phenyl)acetate (prepared as described in ref. 55; 281 mg, 745 μmol) in THF (2.3 ml) cooled at −78 °C was added dropwise a solution 1 M in THF of LiHMDS (1.9 ml, 1.9 mmol).将反应混合物在-78°C下搅拌15分钟，然后在THF（0.25 mL）中加入氯二甲基硅烷（219 mg，2.01 mmol）的溶液。在加入N-溴糖酰亚胺（135 mg，0.751 mmol）之前，将反应混合物在-78°C下搅拌15分钟。使反应混合物缓慢达到室温，并在此温度下搅拌17小时。将反应混合物倒在水（40 mL）上，并用EtOAC（40 mL）提取两次。将组合的有机层用盐水（20 mL）洗涤，然后在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常相闪光色谱（40 g硅胶，环己烷/etoAc 0％至20％）分离粗残留物，在蒸发后给出一个不纯净的中间体，在0.1％aqueous aqueous aqueous tfa中，通过反相制备HPLC（XSElect，35％至100％MECN）进一步纯化。将含有中间体的馏分冻干，将190毫克的丁基2-溴-2--（2 - （（（3-溴苯基）氧）苯基）乙酸苯基（1B）作为冻干（84％纯）。向NMP（2.8 mL）中的冻干剂5-氨基苯甲曲（D] oxazol-2（3h）-One（126 mg，0.839 mmol; Cas，14733-77-8）。将反应混合物在60°C下搅拌21小时。将反应混合物冷却至室温，然后将其倒入水（30 mL）上，并用EtOAC（40 mL）提取两次。将组合的有机层用盐水（30 mL）洗涤两次，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥，以提供227 mg（34％的产率）粗丁基2-（2-（2-（（（3-溴苯甲基））（1C）（90％纯； RT 1.42分钟； MS（ESI+，M/Z）525.1，527.1（BR模式）[M+H]+; MS（ESI-，M/Z）523.1，525.1（BR模式）[m-h] - ;方法a）。
对于含有化合物1c（187 mg，320μmol）氩气的溶液，在2.4 m水溶液CS2CO3（0.3335ml，0.335ml，804 ml，804 ml，0.335ml，804 ml，804 ml）中，化合物1a（178 mg，483μmol）和PD（DBPF）Cl2（19mg，29.2μmol）的溶液。密封反应混合物，并在90°C下搅拌4.5 h。将反应混合物冷却至室温，并用ETOAC（80 mL）和盐水（20 mL）稀释。将有机层在NA2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常闪光色谱法（24 g硅胶，环己烷/etoac 0％至60％）纯化粗残留物，以在蒸发纯馏分和在真空下干燥后给出197 mg（91％的产率）Tert-butyl2-（2 - （（（3 - （（（s）-3-（（（（tert叔丁基碳）氨基）7.13分钟（ESI+，M/Z）680.3 [M+H]+MS（ESI-，M/Z）678.3 [M-H] -The diastereomeric mixture (87 mg) was separated by preparative chiral HPLC to afford after evaporation of the pure fractions and drying under vacuum, 40 mg of the first eluting diastereomer 2a (100% pure; Rt 7.13 min; MS (ESI+, m/z) 680.3 [M + H]+; MS (ESI−, m/z) 678.3 [M-H]−;B分析性手性SFC超过99％;678.3 [M-h] - 方法B。
化合物1d（90 mg，132μmol）在二恶英中用4 m HCl（3 mL，12 mmol）处理。在室温下将反应混合物搅拌6小时。将反应混合物用N2的通量吹出，并在真空下干燥，以提供74 mg（96％的产率）标题非对映异构体混合物，作为粗盐（纯纯）。通过反相制备HPLC（XSelect，0.1％TFA水溶液中的5％至80％MECN）纯化粗盐（20 mg）。将纯馏分冻干以得到17毫克的（R/s）-2-（2 - （（（3 - （（（s）-3-（氨基））-2,3-二氢苯甲酸苯二酚-5-基）苄基）苯基）-2混合物1：1）作为TFA盐冻干的（97％纯； RT 3.25分钟； MS（ESI-，M/Z）522.2 [M-H] - ;方法B）。每个非对映异构体（r）-2-（2 - （（（3 - （（（s）-3-（氨基））-2,3-二氢苯并苯并呋喃-5-基）苯基）苯基）苯基）-2(S)-2-(2-((3-((S)-3-(amino)-2,3-dihydrobenzofuran-5-yl)benzyl)oxy)phenyl)-2-((2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazol-5-yl)amino)acetic acid of the diastereomeric mixture 1 was synthesized from the separated diastereomers 2a and3a使用相同的过程，但适用于刻度，如上所述，对于非对映聚体混合物1，但无法归因显示配置（s，s）或（r，s）的情况。Compound 2a (40 mg) afforded 35 mg (97% yield) of monohydrochloride salt 2 as an off-white solid (97% pure; Rt 3.24 min; MS (ESI−, m/z) 522.2 [M-H]−; method B; more than 99% de; analytical chiral SFC; Chiralpak IG; 50% EtOH + 0.05% (25% aqueousNH3; RT 2.20分钟（M/Z）：[M-H] - C30H24N3O6，522.1665；7.96（d，j = 4.8 Hz，1h），7.73（s，1h），7.60（dd，j = 8.4，2.1 Hz，1h），7.57-7.51（m，1h），7.51-7.45（M，1H），7.51–7.45（m，m，2h），7.401.7 Hz，1H），7.14（DD，J = 8.4，1.1 Hz，1H），6.99 - 6.92（M，2H），6.90（D，D，D， J = 8.6 Hz，1H），6.42（D，J = 2.3 Hz，1H），6.30（DD，J = 8.8，2.5 Hz，1H），5.43（S，1H），5.28（S，2H），5.10-5.06（M，1H）（M，1H），4.75（DD，J = 10.9，8。2 Hz，1H）3.6 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 172.1, 8.4 Hz, 1H), 3.72–3.66 (m, 1H) and compound 3a (39 mg) afforded 35 mg (99% yield) of monohydrochloride salt 3 as an off-white solid (96% pure; Rt 3.20 min; MS (ESI−, m/z) 522.2 [M-H]−;b; chiralpak; chiralpak ig;11.32 ppm（s，1h），8.79（s，3h），7.99（d，j = 2.0 Hz，1H），7.73（s，1h），7.59（dd，j = 8.4，2.1 Hz，1h），7.57-7.51（M，1H），7.51（m，1h），7.51-7.43.43（M，2H）1.7 Hz, 1H), 7.28 (ddd, J = 8.9, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.00–6.93 (m, 2H), 6.91 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.31 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz,1H），5.44（s，1h），5.28（s，2h），5.12–5.06（m，1h），4.76（dd，j = 10.9，8.2 Hz，1h），4.56（dd，j = 10.9，3.6 Hz，1h），1h），1h），4.04（dd，dd，dd，j = 163.8，8.7 hz，1Hz，1h），3.7 Hz，1h），3.13（3.7 Hz，1h），3.13（Mor），3。3.3（Mor），3。3.3（Mor），3。3.3（Mor），3.13（Mor）。
将Cem Pro潮汐酰胺树脂（172 mg，0.1 mmol，0.58 mmol G -1）悬浮在DMF中，并允许膨胀30分钟。使用CEM LibertyBlue合成器合成肽序列。通过在90°C中用5％吡咯烷在DMF中用5％吡咯烷处理2分钟，将FMOC保护组除去。使用FMOC保护的氨基酸（DMF中的0.2 m），DIC（8式，DMF中的1 m）和90°C的oxyma Pure（8 eq，1 m）在90°C下使用酰胺耦合。在相同条件下，使用氯乙酸（4式，0.2 m）在相同条件下使用氯乙酸（4式，0.2 m）限制了组装的肽链。
将树脂转移到带有弗里特的墨盒中，并用DMF和DCM顺序洗涤。用TFA/Water/Tis/Dodt（9.25：2.5：2.5：2.5：2.5，6 ml）用树脂处理1.5 h，然后过滤。将滤液收集在干冰冷冷的二乙基醚/项中（1：1，60 mL）。将悬浮液离心（4,500 rpm，持续6分钟），溶液仔细倒入。将所获得的固体悬浮在干冰冷冷的二乙醚（60 mL）中，然后再次离心。倒在上清液后，将粗线肽颗粒干燥在氩气流下。随后，将其溶解在乙腈/水（1：1，25 mL）和二培（0.5 mL）中。将混合物在室温下搅拌1小时，然后冷冻并进行冻干，以提供粗制的环状肽AC {14} -phe-lys-lys-asp-asp-trp-trp-trp-trp-trp-gly-gly-gly-gly-ile-ile-trp-phe-asp-phe-asp-phly-ass-asp-phly-val-val-val-val-val-val-val-val-val-cys {0} -nh2（4）（4）（补充图。1B）。通过制备HPLC纯化肽4（Xbridge，在0.08％NH4HCO3水中，乙腈5％至80％）。这提供了无盐形式的肽4（39.8 mg，纯度99％以上，方法C；产量22％）。HRMS（M/Z）：[M+ 2H] 2+计算。对于C88H112N18O22S 902.3954，发现了902.3942（补充图1C）。
悬浮在2-（2-羟基苯基）乙酸甲酯（500 mg，3 mmol; CAS，22446-37-3），（5-溴-2-氯苯基）甲醇（816 mg，3.61 mmol; CAS，149965-40-2）和Polystyremer polymersyl polimersyl prolimersyl prolimersyl triveanyl trivehyl triveanyl trivehyl triveanyyl triveanyl trivehyl;添加了氩气下无水THF（20 mL）中的3.63 mmol）。在室温下搅拌反应混合物20.5 h。将反应混合物过滤在硅藻土上。将滤液用ETOAC（80 mL）稀释，并用盐水（20 mL）洗涤两次，然后在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。The crude residue was purified by normal-phase flash chromatography (40 g silica gel, cyclohexane/EtOAc 0% to 25%) to give after evaporation of the pure fractions and drying under vacuum, 976 mg (88% yield) of methyl 2-(2-((5-bromo-2-chlorobenzyl)oxy)phenyl)acetate (5a; Supplementary Fig. 1d) as灰白色固体（100％纯； RT 1.50分钟； MS（ESI+，M/Z）369.0，371.0（BRCL模式）[M+H]+;方法A）。在液管THF（8 mL）中以-78°C冷却的无水THF（8 mL）的化合物5a（976 mg，2.64 mmol）的溶液，滴一滴在LIHMDS（6.9 mL，6.9 mmol）的1 m中液滴溶液。将反应混合物在-78°C下搅拌15分钟，然后在THF（2 mL）中添加氯二甲基硅烷（774.5 mg，7.13 mmol）的溶液。在加入N-溴糖酰亚胺（500 mg，2.78 mmol）之前，将反应混合物在-78°C下搅拌30分钟。使反应混合物缓慢达到室温，并在此温度下搅拌16.5小时。将反应混合物倒在水（80 mL）上，并用EtOAC（80 mL）提取两次。将组合的有机层用盐水（60 mL）洗涤，然后在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过闪光色谱（40 g硅胶，环己烷/二氯甲烷0％至25％）分离原始残留物，在蒸发和在真空下蒸发和干燥后给出，1.02 g（74％的产率）甲基2-溴-2-（2-（2-（2-（（5-溴）） 作为淡黄色的粘油（86％纯； RT 1.56分钟；方法A）。在NMP（2.5 mL）中的Argon下的化合物5b（200 mg，446 µmol）中，5-氨基苯甲氮[D] Oxazol-2（3H）-ONEON（135 mg，899 µmol; CAS，CAS，14733-77-8）。将反应混合物在80°C下搅拌1.5 h。将反应混合物冷却至室温，然后将其倒入水（70 mL）上，并用EtOAC（60 mL）提取。用盐水（20 mL）将有机层洗涤两次，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过反相制备HPLC（Xbridge，40％至100％MECN中的0.1％水性TFA水溶液）纯化粗残留物。将纯级分蒸发至干性，得出171 mg（71％的产率）2-（2 - （（（5-溴-2-氯苯基）氧）苯基）-2 - （（2-oxo-2,3-氧气-2,3-二氢苯甲酸[d] - 5 c（5 c）含量（5 c），均为5 c（5 c）。MS（ESI+，M/Z）516.9，518.8，520.9（BRCL模式）[M+H]+;溶液中含有5C化合物（171 mg，317μmol），苯基酸（45 mg，358μmol; cast，98-80-6），PD（DBPF）Cl2（30 mg，46μmol）中的苯基酸（46μmol）中添加了2.4 ml（4 mL）2.4毫升2.4 m osqus cs2col（46μmol）。密封反应混合物，并在90°C下搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温，并用ETOAC（80 mL）和盐水（20 mL）稀释。将有机层在NA2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常相闪光色谱（12 g硅胶，环己烷/etoac 0％至50％）分离粗残留物，以在纯级分蒸发和真空下干燥后给出125 mg（65％的产率）甲基甲基2-(2-((4-chloro-[1,1′-biphenyl]-3-yl)methoxy)phenyl)-2-((2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazol-5-yl)amino)acetate (5d) as an off-white foam (85% pure; Rt 1.41 min; MS (ESI+, m/z) 515.3,517.3（CL模式）[M+H]+MS（ESI-，M/Z）513.3，515.2（Cl模式）[M-H] -向二恶英（3.5 mL）中的化合物5d（125 mg，206μmol）的溶液添加1 m水溶液 （0.7 mL，700μmol）。将反应混合物密封并在40°C下搅拌1.25 h。将反应混合物冷却至室温，并加入2 M水溶液（66.1μL，132μmol）。将反应混合物冷却至室温，并用水（30毫升）淬火。用2 M水溶液在pH 2周围调节溶液，并用ETOAC（40 mL）提取两次。将组合的有机层在NA2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过反相制备HPLC纯化粗残留物（XSElect，0.1％TFA中的40％至100％MECN）。浓缩纯部分，并在4°C下冷却1小时。将沉淀物过滤并用水洗涤，然后在真空下干燥，以得到83 mg（79％）（RAC）-2-（2 - （（4-氯 - [1,1'-二苯基] -3-基）-3-基）-3-基）甲氧基）苯基）-2（98％纯; RT 6.32分钟； MS（ESI+，M/Z）501.0，502.9（Cl模式）[M+H]+; MS（ESI-，M/Z）499.1，501.1（CL模式）[M-H] - ;方法B;方法B; HRMS（M/Z）：[M+H]+H]+HRMS（m+H]501.1215; 1H-NMR（600 MHz，D6-DMSO）δ12.75ppm（BRS，1H），11.21（S，1H），8.00（D，J = 2.3 Hz，1h），7.684H），7.31（TD，J = 7.8，1.7 Hz，1H），7.18（D，J = 8.2 Hz，1H），6.99（t，j = 7.5 Hz，1H），6.86，6.86（d，j = 8.6 Hz，1H），6.40（D，J = 2.2 Hz，1H），5.38–5.30（M，2H）;128.08，127.81，127.61，127.25，126.97，126.58，121.17，121.17，112.58，109.49，105.37，94.73，67.06，67.06，54.2 3真空，然后是反相制备HPLC（XSelect，30％至100％MECN在0.1％TFA中）， 23毫克作为标题化合物映体的灰白色固体（S）-5（纯度为96％；超过99.9％的EE；分析性手性SFC； Chiralpak ig 100×4.6 mm 5 µm 35％35％（iproh+0.05％+0.05％squous 25％NH3）；（PDB：9BTP）和24毫克作为标题化合物映体（R）-5（95％纯; 99.6％EE：分析性手性SFC; Chiralpak IG 100×4.6 mm 5 µm 5 µm 35％）（iproh+0.05％aqueous 25％NH3）; rt 4.15 min; rt 4.15 min。
4-（苯氧基）-3-硝基苯甲醛（490 mg，1.91 mmol; cas，22955-07-3），（S）-2-甲基 - 丙烷-2-硫素胺（277 mg，277 mg，2.29 mmol; cas，343338-28-28-28-28-28-3），copper（II copper（II），（S）22955-07-3），（s）-2-甲基丙烷-2-甲醛。密封二氯甲烷（4.800毫升）中的5.33 mmol）在50°C下搅拌5 d。将反应混合物冷却至室温，并通过硅藻土过滤。将其余的固体用二氯甲烷（50 mL）洗涤。将滤液蒸发至干性，并通过正常相闪光色谱法（40 G硅胶，二氯甲烷/EtOAC 0％至20％）纯化粗液，以在蒸发纯级分和在真空下蒸发后进行干燥后，603 mg（88％的产率）(S,E)-N-(4-(benzyloxy)-3-nitrobenzylidene)-2-methylpropane-2-sulfinamide (6a; Supplementary Fig. 1e) as an off-white solid (100% pure; Rt 1.24 min; MS (ESI+, m/z) 361.1 [M + H]+; method A; HRMS (m/z): [M + H]+ calcd对于C18H21N2O4S，361.1222; 361.1217;1H），7.50–7.32（M，5H），5.42（S，2H），1.18（S，9H））。向中间6A（440 mg，1.22 mmol）在二氯甲烷（8 mL）下的溶液中加入argon的溶液，加入BF3.OET2（346.5 mg，2.44 mmol）。将反应混合物在室温下搅拌0.75 h，然后加入（（1-甲氧基-2-甲基-2-甲基-1--1-EN-1-基）氧）三甲基硅烷（425.6 mg，2.44 mmol）在二氯甲烷（425.6 mg，2.44 mmol）中。将反应混合物密封并在室温下搅拌21.5 h。将反应混合物用二氯甲烷（40 mL）和盐水（20 mL）稀释。用二氯甲烷（40 mL）萃取水层，并在NA2SO4上干燥合并后的有机层，过滤并蒸发至干燥。通过正常相闪光色谱（80 g硅胶，二氯甲烷/etoac 0％至40％）纯化粗残留物，以在蒸发纯馏分（首次洗脱iatereomer）和在真空下干燥后给出164.3 mg（29％的产量）（29％的产量） 甲基（r）-3-（4-（苯并氧）-3-硝基苯基）-3 - （（（（（（S）-Tert-tert-叔丁基磺胺基）氨基）-2-2-2-2-二甲基 - 丙酸（6B）作为油为油为油（100％纯; Rt 1.18 min; rt 1.18 min; MS（ESI+，M/Z）463.463.4 [MS/z）[MS+H]+H; MS+H; MS+H; MS+; MS+; MS+; MS;461.3 [M - h] - 方法2.3 Hz，1h），7.49–7.38（m，5h），7.38–7.32（m，1h），5.57（d，j = 11.1 Hz，1h），5.31（s，2h），4.56（d，d，j = 11.1 Hz，1h），3.59（3.59（3.59）（S，3H）。（ESI+，M/Z）463.5 [M+H]+（ESI-，M/Z）461.3 [M - h] - 方法A;ppm（d，j = 2.2 Hz，1h），7.58（dd，j = 8.8，2.3 Hz，1h），7.48–7.38（m，5h），7.38-7.31（m，m，1h），5.47（d，d，j = 8.0 Hz，1h）3H），1.14（s，3h），1.05（s，3h），1.01（s，9h），并用于通过小分子X射线进行评估，以与其映射的6C，26.8 mg（产量21％）的甲基化合物相比，与新形成的立体中心的构型合成，以类比为类似（s）-3 - （（（（（（s）-tert-叔丁基）氨基）-2,2-二甲基-3-（2-oxo-2,3-二氢苯并[D] oxazol-5- 5-基）丙酸丙酸酯（7b）作为固体的固体（7B）作为固体（99％pure; rt 3.68 min; rt; rt; rt; rt; rt; rt; rt; rt; rt; rt; ms+s+s+ms/+ms/+s/s/s/s/s/s/+h。M/z）367.2 [M-H] - 方法B（M/z）：[M+ H]+ C17H25N2O5S，369.14847.02–6.95（M，2H），5.37（D，J = 7.5 Hz，1H），4.53（D，J = 7.5 Hz，1H），3.63（S，3H），1.15（S，3H），1.04（S，S，3H），1.00（S，3H），1.00（S，9H）;142.44，135.10，129.84，122.11，109.61，108.55，65.41，55.38，51.89，47.67，22.48，22.48，22.14，20.97S-configuration;www.ccdc.cam.ac.uk/structures）。将化合物6b（164.0 mg，355μmol）在THF（3.600 mL）和EtOAC（1.800 mL）中的溶液中加入N2和PD-C（50 mg，10％重量，47.0μmol）的溶液。将反应混合物用H2冲洗，并在1.1 bar H2以下的室温下搅拌2小时。将反应混合物在硅藻土上过滤，并用ETOAC（25 mL）和THF（10 mL）洗涤催化剂。将滤液蒸发并干燥以使128毫克的粗中间体（90％纯度； RT 0.62分钟； MS（ESI+，M/Z）343.1 [M+H]+; MS（ESI-，M/Z）341.2 [m- h] - h] - ;方法A）。加入在二氯甲烷（3.400 mL）和三乙胺（103.3 mg，1.020 mmol）中取。将溶液在冰浴中冷却，并加入双苯二甘烯（40.4 mg，204.1μmol），然后在0°C下在0°C和75分钟的室温下搅拌反应混合物0.5 h。将反应混合物在冰浴中冷却，并用饱和水NAHCO3（1 mL）淬灭，然后用二氯甲烷（40 mL）和盐水（20 mL）稀释。用二氯甲烷（30 mL）提取水层，并用盐水（20 mL）洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常相闪光色谱（24 g硅胶，二氯甲烷/MeOH 0％至5％）纯化粗残留物，以在蒸发纯级分和在真空下干燥后给出45.4 mg（33％的产率）甲基甲基（R）-3 - （（（（（s）-tert叔丁基磺胺）氨基）-2,2-二甲基-3-（2-oxo-2,3-二氢苯甲酸[D] oxazol-5-5-基）作为膜（6C）作为膜（6C）作为膜（97％纯； 97％pure; rt 3.69 min; rt 3.69 min; ms（Esi+，m/z）368.98.98.98.M.9 [MS/M/M/M/Z] [MS/M/M/Z] [MS/M/Z] [MS/M/M MS（MS/MS/MS）[MS/MS/+H]M/z）367.1 [M-H] - 方法B;1H-NMR (500 MHz, d6-DMSO) δ 11.69 ppm (s, 1H), 7.2–7.16 (m, 2 H), 7.06 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.58 (s, 3H),1.12–1.04（M，12H），0.95（S，3H）;13C-NMR（126 MHz，D6-DMSO）δ175.95，154.60，142.47，135.54，129.71， 122.50，109.97，108.34，66.67，55.90，51.68，47.81，23.39，22.57，19.92。在二氧烷（27.3μl，109μmol）中加入4 M HCl的化合物6C（20.1 mg，54.6μmol）在二氯甲烷（0.350 mL）中的溶液。将反应混合物密封并在室温下搅拌1.25小时。将反应混合物用N2的通量吹出，并在真空下干燥。向氩下的残留物添加了2-（3-碘）乙酸（17.2 mg，65.5μmol; Cas，1878-69-9）在DMA（0.550 mL）中，先前用三乙胺前治疗的DMA（0.550 mL），用三乙胺（19.3 mg，19.3 mg，26.6μl，3.5 eq，3.5 eq，191 eq，1.7.7 eq，1.7 eq，1.7 eq，1.7）76.4μmol）在室温下3分钟。在室温下搅拌反应混合物40分钟。将反应混合物用ETOAC（50 mL）稀释，并用盐水（4×25 mL）洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发至干燥。通过正常闪光色谱法（12 g硅胶，二氯甲烷/etoac 0％至60％）纯化粗残留物，以在蒸发纯馏分并在真空下干燥后给出16.8 mg（59％的产率）甲基甲基(R)-3-(2-(3-iodophenyl)acetamido)-2,2-dimethyl-3-(2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazol-5-yl)propanoate (6d) as a film (98% pure; Rt 1.00 min; MS (ESI+, m/z) 509.0 [M + H]+; MS (ESI−, m/z)507.1 [M-H] - 方法A）。在二氧烷（0.330 mL）中的化合物6d（16.8 mg，33.1μmol）的溶液中，1 m水溶液（132μl，132μmol）。将反应混合物密封并在50°C下搅拌5.5 h。在室温下冷却反应混合物，并加入2 M水溶液（66.1μL，132μmol）。用N2通量吹出反应混合物，并通过反相制备HPLC（Xbridge，5％至100％MECN中的0.1％水性TFA水溶液）纯化粗残基。将纯馏分浓缩并冻干以得到10.1 mg（61％）（R）-3-（2-（3-碘苯基）乙酰胺）-2-2-2-二甲基-3-（2-oxo-2,3-氧气-2-3-二氢苯甲酸[D]甲状腺毒素 - 5-5-基-5-基）丙诺丙基酸（6）per lyoplizate as a Mine as a Mine sine sine sim MINET pureoplizate（98％）（98％）（98％）；（ESI+，M/Z）495.0 [M+H]+（ESI-，， m/z）493.1 [m - h] - ;方法b;94％EE；分析性手性SFC；chiralpak ih;30％MEOH+0.05％（25％水溶液NH3）;RT 2.34分钟；HRMS（M/Z）：[M+ H]+ C20H20IN2O5，495.0417;发现，495.0411；1H-NMR (500 MHz,d6-DMSO) δ 12.49 ppm (brs, 1H), 11.66 (s, 1H), 8.48 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.61 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 7.56 (ddd, J = 7.8, 1.8, 1.1 Hz, 1H), 7.27–7.17 (m,2H），7.08（t，j = 7.8 Hz，1h），7.02–6.95（m，2h），5.24（d，j = 9.8 Hz，1H），3.57–3.45（m，2h），1.06（s，s，3h），1.01（s，3h）;13C-NMR（151 MHz，D6-DMSO）δ177.12，169.14，154.54，142.30，139.01，137.57，135.60，135.00，135.00，130.35，129.88，129.88，128.4122.27，21.17。（s）-3-（2-（3-偶氮基）乙酰氨基）-2,2-二甲基-3-（2-oxo-2,3-二氢苯并[D] oxazol-5-基-5-基）丙酸（7）作为白色溶性（100％4.30 min; rt 4.30 min; rt 4.30 min; msi; msi+sii+s/z）[MSI+，MS/MS）M/z）493.0 [M - H] - 方法B；分析性手性SFC；chiralpak ih;30％MEOH+0.05％（25％水溶液NH3）;RT 2.03分钟；HRMS（M/Z）：[M+ H]+ C20H20IN2O5，495.0417;发现，495.0410；1H-NMR（500 MHz，D6-DMSO）δ12.46ppm（BRS，1H），11.64（S，1H），8.48（D，J = 9.5 Hz，1H），7.61，7.61（T，t，j = 1.8 Hz，1H），7.56（D，J = 7.7 Hz，1hz，1h），1Hz，1h），7.27-17-17-17-17-17（MM），M.7（MM），7（MM）。（t，j = 7.7 Hz，1H），7.02–6.95（m，2h），5.24（d，j = 9.7 Hz，1H），3.55–3.46（M，2H），1.06（S，3H），1.02（S，3H）;13C-NMR（151 MHz，D6-DMSO）δ177.13，169.12，154.54，142.30，139.00，137.57，137.57，135.63，135.00，130.33，129.88，128.88，128.4022.30，21.23）用类似于中间体6C转化为中间7b的化合物6（总产率为57％）。
A，Shoc2（绿色动画片）和NRA（橙色）之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用界面。B，Shoc2中的单个可韧带位点（粉红色表面）位于Shoc2 -Ras界面。C，通过无偏屏幕在PPI界面处识别的肽4（蓝色表面）在同一位点结合。D，低分子量化合物（R）-5（黄色表面）在同一结合位点重叠。E，肽4（蓝棍）和化合物（R）-5（黄色棒）的原子重叠。尽管肽较大，并延伸到Shoc2的N末端部分，但它与低分子量的化合物界面重叠。在肽和低分子量化合物之间保留关键接触。F，肽4 ASP11的关键碳酸和化合物（R）-5的亮点，该碳纤维与R223相似的盐桥以及氢键与Q269相似。G，肽4的Phe10和Val13之间的关键油腻相互作用的亮点，化合物（R）-5的氯 - 双苯基基团与E311，R288，R288，N265，T242和D244的侧链的烷基部分扩展疏水接触。Apo Shoc2的3D结构不会表现出可以容纳小分子的常规埋入腔。尽管可以在Shoc2 -PP1CA和Shoc2 -MRAS相互作用界面上找到相对较大的口袋12，但Apo Shoc2的表面相当平坦。然而，在Shoc2的凹面上有一个疏水片，带有RAS的PPI。该斑块的埋藏表面有限为236Å3，平均疏水性为34％，总可韧性估计为中等17（PDB代码：7YTG）。口袋的主要疏水残基是Met219和Thr242的侧链以及ASN265，ARG288，GLU311和ASN313的烷基链；以及残基Leu220，Leu243，Leu266，Leu289，Gly290和Leu312的骨干。口袋内的极性残基是SER221，ARG223，ASP244，ASP267，GLN269，ARG288，ARG292， GLU311和ASP313。塑造结合位点的关键残留物是长时间柔性的侧链，可以自由移动（三个ARG和一个GLU）。七个带电的氨基酸正在定义结合位点的静电和极性。总的来说，该结合位点的有限的“埋藏性”和疏水性，结合了形成其的关键氨基酸侧链的灵活性以及该口袋中的大量正式电荷，这使得它在开发有效的低分子量的有效低分子重量粘合剂方面尤其具有挑战性。在SHOC2的现有晶体结构中，没有其他可韧带的腔体能够表征，这使其成为抑制剂发展的艰巨靶标。
除非图中的图例另有说明，否则将所有实验重复三次或更多次，除非结果相似。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
