Antibodies were procured from the following: H3K36me3 (Abcam, catalogue no. ab9050), γH2AX (Millipore, catalogue no. 05-636 for IF), γH2AX (Cell Signaling Technology, catalogue no. CST9718 for western blot), pRPA2S33 (Novus Biological, catalogue no. NB100-544),PCHK1S345（Invitrogen，目录号PA5-34625），53BP1（Novus Biological，目录，NB100-304），Cyclin A（BD Biosciences，CatalogNo。611268），Prnapii S2/S4（Prnapii S2/S4（ABCAM，catalog no catalog catalog no catalog no catalog no catalog no catalog n ob255555 call ob255555，ab255）ab25555555555（ab2555555）（信号技术，目录号。no。
化学品是从以下方法中获取的：CHIR-124（SelleckChem，CatalogNo。S2683），XL413（SelleckChem，CatalogNo。S7547）和Triptolide（Millipore，CatalogNo。645900-5MG）。
GBM39EC，GBM39HSR和HK296是患者衍生的神经圈细胞系，如前所述2,7。父母PC3线是从ATCC获得的。Mischel Lab通过父母PC3线的单细胞扩展隔离了PC3 DM和PC3 HSR线，可应要求从Mischel Lab获得。所有其他细胞系都是从ATCC购买的。人前列腺癌细胞系PC3 DM，PC3 HSR；结直肠癌细胞系COLO320DM，COLO320HSR;胃癌细胞系SNU16;肺癌细胞系PC9和HTERT降低的视网膜色素上皮细胞系RPE1在4.5 g L-1葡萄糖成型的Dulbecco的修饰的Eagle的培养基（Corning）中，并补充了10％胎儿牛血清（FBS； Gibco）。对于Gro-Seq和Chip – Seq，Colo320DM和Colo320HSR在Roswell Park Memorial Institute 1640种植，Glutamax（Gibco）（Gibco）为10％FBS。GBM39ec, GBM39HSR and HK296 cell lines were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (Gibco, catalogue no. 11320-033) supplemented with 1× B27 (Gibco, catalogue no. 17504-01), 20 ng ml−1 epidermal growth factor (Sigma, catalogue no.E9644），20 ng ML-1成纤维细胞生长因子（Peprotech，目录号AF-100-18B），1-5 µg ML-1肝素（Sigma，Sigma，CatalogNO。H3149）和1×Glutamax（Gibco，Gibco，Catalogno。35050-061）。在没有其他谷氨酸的情况下培养了用于测序测定中的GBM39细胞。所有细胞在与5％CO2的加湿孵化器中保持在37°C。细胞系常规测试了支原体污染的阴性。
COLO320DM and COLO320HSR RNA was prepared by washing cells with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), then adding ice-cold LB (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 0.5% IGEPAL-CA630, 10% glycerol, 1 mM DTT, protease inhibitors (Roche, catalogue no.11836170001），RNase抑制剂（Ambion，CatalogNo。Am2696）和将细胞刮入15 mL圆锥管中。细胞在4°C下以1,000g的1,000g旋转10分钟。除去上清液，并使用宽孔尖端将沉淀彻底重悬于1 ml lb中。加入另外9毫升磅，然后在4°C下以1,000克旋转10分钟。将细胞重悬于LB中并旋转。将颗粒重悬于冰冷的冷冻缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8.3、5 mM MGCL2、40％甘油，0.1 mM EDTA，0.2μl每毫升冷冻缓冲液），在4°C下以2,000g旋转2,000g。将细胞核重悬于每500万细胞中的100μl冷冻缓冲液中。A nuclear run-on master mixed was prepared (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 300 mM KCl, 0.5 mM ATP, 0.5 mM GTP, 0.003 mM CTP (unlabelled ribonucleotide triphosphates from Roche, catalogue no. 11277057001), 0.5 mM Bromo-UTP (Sigma,目录号。B7166），1％Na-laurylsarcosine，每100μl1μLRNase抑制剂），并预热至30°C。将相同的主混合物添加到等分的核（每次重复500万个核）中，并在30°C下孵育5分钟，并轻轻摇动。使用RQ1 DNase I和RQ1缓冲液（Promega，CatalogNo。M610A）在37°C下进行30分钟进行DNase消化；将停止缓冲液添加到最终浓度为10 mM Tris-HCl pH 7.4、1％十二烷基硫酸钠（SDS），5 mM EDTA，1 mg ML-1蛋白酶K。样品在55°C下孵育1小时，将反应停止。将NaCl添加到225毫米的最终浓度中。进行了两种酚类提取，然后用氯仿提取。用1μL糖布鲁（Ambion，CatalogNo。9516）在-20°C下将RNA在75％EtOH中沉淀。
对于GBM39EC和GBMHSR，将细胞用冰冷的PBS洗涤，然后在4°C下500g旋转5分钟。然后将细胞重悬于冰冷的10 mL肿胀缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MGCL2、3 mM CaCl2，蛋白酶抑制剂，RNase抑制剂），并在冰上孵育5分钟。细胞在400g的4°C下旋转10分钟，并将其重悬于10 ml冰冷的甘油溶胀缓冲液（0.9倍溶胀缓冲液，10％甘油）中。在搅拌管时，慢慢加入了10 mL冰冷的裂解缓冲液（甘油溶胀缓冲液，1％igepal-CA630）。将样品在冰上孵育5分钟，然后再加入25 mL裂解缓冲液，并在4°C下在600克旋转5分钟。将样品重悬于冰冷的冷冻缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mM MGCL2、40％甘油，0.1 mM EDTA，RNase抑制剂），并在4°C下在900G下旋转600g。将相等体积的预热核跑步主混合添加到等分的核（每次复制1000万个核）中，并在30°C下孵育7分钟，并轻轻摇动。然后将样品与600μlTrizolls充分混合，并在室温下孵育5分钟。接下来，将160μl氯仿添加到每个样品中，剧烈摇动，然后在室温下孵育3分钟，然后在4°C下以12,000克离心30分钟。将NaCl添加到水相中，将300 mm的最终浓度添加到75％EtOH中，并在-20°C下用1μl胶合体沉淀。
对于所有细胞类型，过夜RNA沉淀后，RNA在4°C时在21,130克旋转20分钟。将RNA颗粒洗涤在新鲜的75％ETOH中，短暂气干，然后重悬于20μl水中。使用5μL1N NaOH进行碱基水解10分钟，然后用25μL1M Tris-HCl pH 6.8中和。使用P30微柱（Bio-Rad，CatalogNo。7326250）进行缓冲液交换，然后用RQ1 DNase I和RQ1缓冲液处理，并在37°C下孵育（Colo320 10分钟和30分钟，GBM39）。缓冲区交换再次执行。样品用3μLT4T4多核苷酸激酶（PNK；新英格兰Biolabs，CatalogNo。M0201），1×PNK缓冲液，2μL10 mM ATP和2μLRNaseRNase抑制剂，并在37°C下孵育1 h。每个样品增加了另外2μLPNK，并继续孵育30-60分钟。通过添加氯化铵（最终浓度50毫米），PoloAxamer 188（最终浓度为0.1％），2μL信使RNA脱氨酸酶（新英格兰Biolabs，CatalogNO。M0608S）和1μLRNase抑制剂和在37°C下于37°C启动。然后将EDTA添加到25 mm的最终浓度中，并在75°C下孵育5分钟。然后将样品在冰上孵育至少2分钟。然后，用结合缓冲液（0.25×SSPE，1 mM EDTA，0.05％Tween 20，37.5 mm NaCl，RNase抑制剂）将样品体积带到100μL。在T4 PNK处理过程中，每样品中的60μL抗Brdu琼脂糖珠（Santa Cruz Biotechnology，目录No。SC-32323AC）在500μL结合缓冲液中通过在室温下旋转5分钟，在室温下旋转5分钟，并再次在粘合罩中洗涤。然后将珠在阻塞缓冲液中阻塞（1倍结合缓冲液，0.1％聚乙烯基吡咯烷酮，1 ug mL -1超乳制牛血清白蛋白（BSA），RNase抑制剂） 通过在室温下旋转1小时。然后将珠在结合缓冲液中洗涤两次，并重悬于400μl结合缓冲液中。然后将十分的RNA添加到阻塞的珠子中，并在室温下旋转1小时。然后将珠一次洗涤一次结合缓冲液，一次在低盐缓冲液（0.2×SSPE，1 mm EDTA，0.05％Tween 20，RNase抑制剂）中，在高盐缓冲液中一次（0.2×SSPE，1 mm EDTA，1 mm EDTA，0.05％TWEEN 20，137.5 mm naclase and twiele and rnace ins and rnace ins in con in con）Tris-Edta-Tween20缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，0.05％Tween 20，RNase抑制剂）。所有带有琼脂糖珠的旋转在室温下在1000克时进行2分钟，并在500μl缓冲液中在室温下旋转5分钟，除非另有说明。然后将样品在洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、20 mM DTT，1 mM EDTA，150 mM NaCl，0.1％SDS，RNase抑制剂）中预热至42°C；周期性涡旋在42°C下进行了四个10分钟的管道。将每个重复的洗脱液合并，然后通过酚类氯仿和氯仿（Colo320）纯化RNA，或使用新英格兰Biolabs Monarch RNA清除套件T2030（GBM39）使用柱纯化。使用NEBNEXT小RNA库预备套件（新英格兰Biolabs，CatalogNo。E7330）制备了测序库，并按Novaseq PE150进行了测序。使用Star，v.2.7.10b（参考文献17）将序列数据映射到人类参考基因组（HG38）。荷马（v.4.11.1）使用默认的gro-seq设置在每个链上分别对从头转录本进行了识别。使用SAMTools（V.1.8）过滤MAPQ值小于10的读取。使用Picard-Tools删除了重复的读数。GRO-SEQ信号使用DeepTools Bamcoverage18（v.3.3.1）转换为大翼型格式，其具有以下参数为： - binsize 10-构型-MormalizeSing cpm-有效性元素 - 效率增生3209286105-Excalscaling。
用Quick-RNA MiniPREP试剂盒（Zymo Research，CatalogNo。R1054）分离出每个样品的总RNA，输入为1-2百万个细胞。使用Ribo-Zero（Illumina，CatalogNo。20020596）使用Truseq绞合的总RNA库准备套件构建RNA库。NextSeq 550测序系统（Illumina）每样品产生20-30万×2，75 bp配对的读数。序列数据使用STAR，v.2.7.10b（参考文献17）映射到人类参考基因组HG38，后者遵循编码RNA-SEQ管道。使用SAMTools（V.1.8）过滤MAPQ值少于10的读取。Ribo-Zero信号使用DeepTools Bamcoverage18（v.3.3.1）转换为大翼型格式，并具有以下参数： - binsize 10-构型-MormalizeSing cpm-expectiveActiveCeeptaction-effectexticalMize 3209286105-Excalscaling。
如先前所述的13，进行了Kas-Seq实验13。简而言之，将细胞培养基补充了5 mM N3-甲氧素（终浓度），并将细胞在37°C的六孔板中孵育10分钟。然后，使用标准方案使用君主GDNA纯化试剂盒（NEB T3010）提取基因组DNA，但使用50 µL 25 mm K3BO3在pH 7.0时洗脱。通过混合87.5 µL纯化的DNA，2.5 µL 20 mM DBCO-PEG4-生物素（Dimethylsulfoxide（DMSO）溶液，Sigma，Sigma，CatalogNo。760749NO。760749）和10 µL 10×PB的最终体积，最终体积为100 µl，进行了点击反应。然后将反应在37°C下孵育90分钟。使用AMPURE XP珠纯化DNA，通过在每100 µL反应中添加50 µL珠，在磁台上洗涤珠，两次用80％EtOH洗涤，并在130 µL 25 mm K3BO3中洗脱。然后使用Covaris E220仪器将纯化的DNA剪切至200-400 bp尺寸。Pulldown of biotin-labelled DNA was initiated by separating 10 µl of 10 mg ml−1 Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads (Life Technologies, catalogue no. 65602) on a magnetic stand, then washing with 180 µl of 1× Tween Washing Buffer (TWB; 5 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.5 mM EDTA; 1 M NaCl;0.05％的补间20）。然后将珠重悬于300 µl的2×结合缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mm EDTA，2 m NaCl），加入超声的DNA（必要时将最终体积稀释至最终体积300 µL），并在旋转器上在室温下至少将珠子孵育15分钟。将珠子分离在磁台上，并用300 µL的1×TWB洗涤，并在55°C中在热电混合物中以1,000 rpm摇动2分钟在55°C中加热。将上清液在磁性架上取出，并重复进行TWB洗涤和55°C的孵育。
使用NEBNEXT ULTRA II DNA库预备套件（NEB，CatalogNo。E7645）在珠子上制备库。首先，通过在20°C中在热电混合物中孵育30分钟，在50 µL 1×EB缓冲液中以1,000 rpm摇动30分钟，进行末端修复，加上3 µL NEB NEB ULTER END READ修复酶和7 µL NEB NEB NEB ULTOR EARTA端端修复酶。随后在65°C下孵育30分钟。其次，通过添加2.5 µL NEB适配器，1 µL连接增强剂和30 µL钝连接混合物来结扎适配器，在20°C下孵育20分钟，然后在37°C下添加3 µL用户酶，并在37°C下孵育15分钟（在shefly -Shefling中以1,000 rpm shepling）。将珠子在磁性台上分离，并在55°C下用180 µl TWB洗涤2分钟，在热弹器中1,000 rpm。磁分离后，将珠子洗涤在100 µL 0.1×TE缓冲液中，重悬于15 µL 0.1×TE缓冲液中，并在98°C加热10分钟。通过将5 µL与25 µL 2×2×Neb Ultra PCR Mater混合物一起添加5 µL i5和i7 NEBNEXT测序适配器，并在98°C孵育30 s，而98°C的98°C孵育30 s，98°C的15个循环10 s，65°C，持续30 s和72°C，在30 s和72°C下进行1分钟，然后在5分钟内为72分钟，in 42 in Incumcation in 42 incation in Incumcation in 42 cycation in Incumcation in Incumcation in 42 cyce cy。将珠子分离在磁性架上，并使用1.8×Ampure XP珠清洁上清液。
使用NextSeq 550高输出套件（2×36个周期），在Illumina NextSeq仪器上以配对的格式对库进行了测序。使用Bowtie19,20在以下设置中，将序列数据映射到人类基因组的HG38组件：-v 2-k 2-m 1------------------ x-x 1000。使用Picard-tools（v.1.99）去除重复的读数。Macs2（参考文献21）（v.2.1.1）用于以下参数： - 大众-g -g hs -Barroad -cutoff 0.01 -q 0.01。使用BAMCOMPARE默认设置归一化到输入后生成浏览器轨道。
每次复制300万个细胞在室温下以1％的甲醛固定15分钟，然后旋转，然后在室温下用0.125 m的甘氨酸淬火10分钟，并旋转。将固定的细胞在4°C下以1,300g的含量为1,300g，并用冷PBS洗涤两次，然后在-80°C下储存。在5 mL LB1（50 mM HEPES pH 7.5、140 mM NaCl，1 mM EDTA，10％甘油，0.5％ipegal-CA630、0.25％Triton X-100，Roche Protease抑制剂11836170001）中进行10分钟。将核在4°C下以1,400g的含量为1,400g，并在5 ml lb2（10 mM Tris-Cl pH 8.0，200 mm NaCl，1 mM EDTA，1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，Roche蛋白酶抑制剂）中裂解10分钟，在室温下旋转。将染色质在4°C下以1,400g的含量为1,400g，持续5分钟，并在1 ml的TE缓冲液加上0.1％SDS中重悬于Covaris E220上，并在以下设置上进行超声处理：140 w，10％，10％，每样品600 s，每样品600 s。通过在4°C下以16,000克旋转10分钟来阐明样品。将上清液转移到新的管中，并用两次IP稀释缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mm EDTA，200 mm NaCl，1 mmEgta。0.2％Na-Doc，1％Na-laerylsarcosine，2％Triton X-100）。然后，将50 µL的剪切染色质保留为输入和芯片，在4°C下旋转，用7.5 µg H3K36me3抗体（AB9050）旋转过夜（1：300稀释）。每样品，将100μl蛋白A dynabeads用1 mL冷藏块缓冲液（PBS中的0.5％BSA）洗涤3次，然后在与抗体过夜孵育后添加到染色质中，并在4°C下旋转4 h。将样品在1 mL预燃烧的洗涤缓冲液中洗涤五次（50 mM HEPES pH 7.5，500 mM LICL，1 mM EDTA，1％iPegal-CA630，0.7％Na-Doc），然后1 ml预燃烧的TE+50 mm NaCl。在洗脱缓冲液中洗脱样品（50 mM Tris pH 8.0，10 mm EDTA，1％SDS） 在65°C。将NaCl添加到最终浓度455毫米。将样品与0.2 mg ML-1蛋白酶K在55°C下孵育1小时，然后在65°C下将过夜连接过夜。在37°C下用0.2 mg ml -1 RNAase处理样品2小时，然后用Zymo芯片DNA清洁和浓缩剂试剂盒（D2505）纯化。使用Nebnext Ultra II DNA库预备套件（E7645）制备库，并按Novaseq PE150进行了测序。The sequence data were trimmed by Trimmomatic22 (v.0.36) to remove adaptor and then mapped to the hg38 assembly of the human genome using Bowtie2 (refs. 19,20) with the following settings: --local --very-sensitive --phred33 -X 1000. Reads with MAPQ values less than ten were filtered using SAMtools (v.1.8).使用Picard-Tools删除了重复的读数。使用DeepTools bamcoverage18（v.3.3.1）将芯片– seq信号转换为大翅格格式，其具有以下参数： - binsize 10-构型 - 构型通过cpm -effectextical cpm -effectexticalMize 3209286105 -excalscaling。
在播种细胞之前，将盖玻片涂在100 µg ml-1聚赖氨酸过夜过夜或10 µg ml-1层粘连蛋白，在37°C下1小时。将异步细胞接种到载玻片上，并经过不同的处理。在指示的地方，在收集样品之前，在10 µg mL -1 30分钟内将EDU添加到每个井中。是否如前所述进行DU-IF DNA鱼染色。简而言之，用冰冷的4％多聚甲醛（PFA）固定载玻片15分钟，然后在室温下用0.5％Triton X-100透化15分钟。将样品用PBS在室温下的PBS中的3％BSA阻塞1小时，然后与在4°C下阻止缓冲液稀释过过夜的一抗。第一抗体的稀释比如下：γH2AX，1：500;PRPA2-S33，1：1,000;PCHK1S345，1：250;53bp1，1：500;Cyclin A，1：100;Prnapii S2/S4，1：1,000。用PBS洗涤后，总共三次，每次5分钟，将载玻片与二级抗体在室温下阻止缓冲液中稀释1小时孵育1小时。用PBS洗涤后，用冰冷的4％PFA固定样品20分钟。如果与DNA鱼染色结合，将固定样品用冰冷的0.7％Triton X-100 / 0.1 M HCl（在PBS中稀释）进一步透化10分钟。将DNA在室温下用1.5 m HCl变性30分钟，然后在上升乙醇浓度中脱水。将稀释的鱼类探针（帝国基因组学）预先在75°C下进行3分钟，然后加入风干的载玻片上。在37°C孵育过夜后，用2×SSC洗涤载玻片，以消除非特异性结合，然后进行DAPI染色。在指示的情况下，使用Click-It Plua Edu Alexa Fluor 647 Imaging Kit进行EDU染色（Invitrogen，CatalogNo。C10640）。
根据制造商的协议，使用Qiaamp DNA Mini Kit（Qiagen）从汇合的六孔盘中提取基因组DNA。简而言之，收集单细胞并将其重悬于200 µL 1×PBS中，然后添加20 µL QIAGEN蛋白酶K和200 µL缓冲液AL。将混合物脉冲涡流15 s，并在56°C下孵育10分钟。将200 µL绝对乙醇的体积添加到样品中，并将脉冲涡流持续15 s。将整个混合物移到QIAAMP迷你自旋柱中，并以6,000克离心1分钟。将滤液丢弃，并将500 µL缓冲液AW1添加到色谱柱中。在6,000克离心1分钟后，将色谱柱用500 µL缓冲液AW2进行另一轮洗涤。全速离心3分钟后，将滤液丢弃。然后将色谱柱放入干净的1.5 mL微型试管中，并在6,000g离心1分钟后加入50 µL缓冲液AE以重新构建基因组DNA。
根据制造商的协议，使用NEB的FS DNA库准备套件进行WGS库制备，并使用这些参数：（1）250 ng GDNA用作输入；（2）片段化以18分钟的孵育时间完成，以产生200-450 bp碎片；（3）最终的库大小分布在320–470 bp之间（即，第一个珠子选择是用30 µL的珠子进行的，第二个珠子选择的珠子体积为15 µl）；（4）对四个周期进行了最终的PCR扩增。对Novaseq进行了PE150测序，以在Novogene的覆盖率至少覆盖10倍。在默认设置处使用Trim Galore从RAW FASTQ文件中删除适配器序列，然后使用与BWA-MEM的MAP对齐HG38参考基因组来生成BAM文件。然后将BAM文件上传到Genepattern笔记本电脑中，以进行默认设置下的扩增分析。
我们利用了AmpliconSuite-Pipeline（v.1.2.2，https：//github.com/ampliconsuite/ampliconsuite/ampliconsuite-pipeline）一下，调用了cnvkit（v.0.9.9）43，ampliconArchitect4444（ampliconarchitect44（aa; aa; aa; v.1.3.r8）和amppliconclasss.2 acsass.2 acsass.vier3（; v.1cl.2 ac; vercififier3（v）（; v.vier3（v）（; ver.vier3（v）（; v。简而言之，分析管道首先从全基因组拷贝数调用中标识了焦点扩增的种子区域，然后在种子区域中，AA分析拷贝数和结构变化，共同构建局部基因组图编码结构重排和拷贝数。然后，AA从基因组图中提取基因组路径和循环，解释了观察到的拷贝数和结构变化的变化。AA的输出传递给AC，该输出应用了一种基于规则的方法，以匹配从基因组图提取的拷贝数，结构变化和结构的模式，即已知类型的焦点扩增类型，例如ECDNA。为了最大程度地减少从插入尺寸分布方差得出的测序伪像，我们设置了AmpliconSuite-Pipeline参数-AA_INSERT_SDEVS 9。对于PC3样品， - downSample 1也设置为减少其他测序货架。否则使用默认参数。
对于COLO320DM/HSR，我们从参考文献中利用了一般的eCDNA区域和候选ECDNA结构。10，将坐标提升为HG38。对于GBM39EC/HSR和PC3-DM/HSR，ECDNA区域源自AA输出文件。从DM样品中，在包含感兴趣的ECDNA的AA扩增子中，拷贝数大于十的区域被定义为ECDNA区域。在GBM39EC/HSR中，我们还包括eCDNA区域的VIII缺失。候选ECDNA结构源自AA周期，其中包含最高分配的副本计数（GBM39：EGFR和PC3：MYC）。对于GBM39，ECDNA结构与先前发表的重建11。使用Cycleviz（https://github.com/ampliconsuite/cycleviz）生成圆形ECDNA可视化。基因和焦点扩增拷贝数分别从AA图文件和AC特征基本属性文件得出。使用farture_simarility.py脚本计算焦点放大的结构相似性得分，该脚本在两个焦点扩增之间基于重叠的基因组边界和共享结构变体计算相似性得分。对于PC3样本，我们使用相关的Amplicon_simarility.py脚本获得相似性分数，因为AC无法轻易解决ECDNA的确切边界。
使用分子梳理测定评估了ECDNA中的复制叉速度。将COLO320DM和COLO320HSR细胞接种到板中并允许生长成对数相，新生DNA合成的脉冲标记为胸苷类似物：cldu和idu依次等同的时间。脉冲标记后，收集细胞并使用基因组视觉纤维试剂盒（基因组视觉）嵌入琼脂糖塞。DNA提取，梳理和免疫染色是根据EasyComb服务程序（基因组视觉）进行的。用光纤扫描仪扫描盖玻片，并使用FiberStudio软件（基因组视觉）分析图像。使用具有连续的CLDU – IDU轨道的复制信号计算出叉速度。仅选择了由DNA纤维抗染色的完整信号进行分析。
使用分子梳子测定评估MYC基因座的DNA复制活性。将COLO320DM和COLO320HSR细胞接种到板中并允许成对数相，新生的DNA合成用胸苷类似物标记为脉冲：CLDU和IDU等同的时间。脉冲标记后，收集细胞并使用基因组视觉纤维试剂盒（基因组视觉）嵌入琼脂糖塞。DNA提取和梳理是根据EasyComb服务程序（基因组视觉）进行的。靶向MYC基因座的DNA标记的纤维纤维（基因组视觉）被产生并杂交与组合DNA。通过测量对照样品中的杂交探针长度来验证理论和实验探针覆盖模式之间的对应关系。复制信号和DNA探针免疫染色后，用光纤扫描仪扫描盖玻片。使用FiberStudio软件（基因组视觉）进行图像分析和测量。使用具有连续的CLDU – IDU轨道的复制信号计算出叉速度。
碱性彗星鱼测定是根据文献进行的，次要修改为45,46。通过胰蛋白酶消化收获细胞，用PBS洗涤并放在冰上。将细胞在37°C的低熔点（LMP）琼脂糖（IBI科学）中稀释，最终浓度为0.7％，并在带有盖玻片的预涂的载玻片上扩散。在碱性裂解溶液（2.5 m NaCl，100 mM EDTA，10 mM Tris pH 10，1％Triton X-100，10％DMSO）中，在4°C下进行过夜裂解。第二天，在碱性电泳缓冲液（200 mM NaOH，1 mm EDTA，pH小于13）中，将载玻片平衡30分钟，然后在Coplin jar中平衡，随后在25 V处电泳30分钟。然后用TRI中和载玻片在70％乙醇中脱水，并在室温下干燥。
为了通过鱼检测ECDNA，从可音调节至150 bp的RP11-440N18 BAC DNA产生Cy5标记的探针，并使用DNA标记试剂盒（Mirus Bio）进行了标记。将载玻片用0.5 M NaOH在室温下定性30分钟，在乙醇系列（70％，85％，95％）中脱水，并在室温下干燥。将含有探针DNA（每载载磁体为200 ng）和COT-1 DNA（每载片8μg）的杂交混合物分别在75°C下分别变性10分钟，并在37°C下预先播放1小时。将探针添加到载玻片上，并用玻璃盖玻片扩散，并在37°C下孵育过夜，过夜。第二天，将载玻片在2×SSC中洗涤四次，在42°C下进行50％甲酰胺，随后在42°C的2×SSC中洗涤两次。将载玻片短暂浸入70％的乙醇和气干中。将载玻片与装有Sybr Gold（Invitrogen）稀释的Everbrite（Biotium）安装，并用指甲油密封。使用×60的油目标，在尼康日食TE2000-E上收集图像。
如前所述47，使用CellTiter-Glo（Promega，CatalgoueNo。G8461）进行细胞活力测定。简而言之，在添加抑制剂之前，将细胞接种到384孔板中。第二天将相等的车辆或在指定浓度稀释的车辆或药物中添加到每个井中，并将细胞孵育三天。在第三天，在室温下平衡板和CellTiter-GLO试剂30分钟后，将试剂添加到每个孔中，并在室温下孵育15分钟。使用Synergy 2微板读取器测量发光。每种情况都进行了四个生物学重复。用GraphPad Prism（v.9.1.0）进行数据分析。
进行TUNEL分析（Invitrogen，目录号C10617）以检测凋亡过程中的DNA片段化。COLO320DM，COLO320HSR和SNU16细胞用1 µM CHIR-124处理指定的时间。收集包括浮动细胞在内的所有细胞，并使用细胞传（Thermo Scientific Cytospin 4离心机）旋转到载玻片上。将载玻片用4％PFA固定，并用0.25％Triton X-100透化，然后通过TDT酶在37°C的Humidified室内通过反应将自由双链端与EDUTP进行标记60分钟。根据制造商的手册在37°C的手册30分钟，通过Click-IT加上TUNEL反应检测到并入的EDUTP。用DAPI对载玻片进行反染色，并用延长的钻石抗固定。
使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，CatalogNo。556547）通过流式细胞仪检测细胞凋亡。在指定的时间内用1 µM Chir-124处理细胞，并收集所有包括浮动细胞的细胞。用PBS两次洗涤和细胞数计数后，将细胞重悬于试剂盒提供的1×结合缓冲液中，浓度为每毫升1×106个细胞。将一百微米的细胞悬浮液转移到FACS管中，并用FITC Annexin V和碘化丙啶染色。在室温下孵育15分钟后，将所有样品在1小时内用BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）分析。通过Beckman Coulter Kaluza软件（v.2.1）分析流式细胞仪数据。
通过常规荧光显微镜或共聚焦显微镜拍摄图像。使用×63油目标在LAS X软件（V.3.8.2.27713）上在Leica DMI8广场显微镜上进行常规荧光显微镜。使用ZEN（Black V.2.3）（Stanford CSIF设施）在Zeiss LSM 880倒置显微镜上进行共聚焦显微镜。除了图3A之外，还为每个视野进行了z堆栈，并确定了一个最佳的对焦堆栈进行下游图像分析，其中imagej（v.1.53t）进行了最大投影。
使用开源软件CellProfiler（V.4.2.1）进行图像分析和定量。为了进行焦点数分析，DAPI染色，如果分别通过自动阈值和分割为细胞核，PRPA2S33/γH2AX灶和DNA Fish焦点分析染色和DNA鱼通道。使用基于对象的共定位方法进行共定位。对于荧光强度测量，通过自动阈值和分割来根据DAPI通道调用核。通过测量每个核内的平均荧光强度来检索平均荧光强度。
基因集变异分析48用于评估使用RNA-Seq Data49在TCGA样品中DNA RS响应（RSR）基因SET20的富集。根据DNA RS反应中缺陷影响的基因，对RSR基因集进行了策划。从GDC数据门户中检索了每千倍酶的RNA-seq转录本的TCGA样品值。基因集变异分析产生了上调的RSR基因和下调的RSR基因的富集评分。最终的RSR得分被确定为向上和向下富集分数之间的差异。
来自TCGA的每个样本的RS签名得分是从参考文献中从文献中获取的。21，通过减去最小分数和除以最大分数，将其线性转换在零和一个之间。TCGA样本ECDNA状态分类如先前的出版物1所述。
简而言之，通过AC（https://github.com/ampliconsuite）将1,921个TCGA样品分为五个亚型：ECDNA，Breakage-Fusion-Fusion-Bridge，复杂的非循环，线性和没有扩增。由于从短阅读数据中检测ECDNA的挑战，从分析中删除了具有断裂 - 融合桥或复杂非环状状态的样品。线性扩增和没有扩增的样品被归类为ECDNA-。在分析中包括232个ECDNA+和582个ECDNA-样品，去除了不匹配ECDNA+样品的转移样品和ECDNA样品后，分析中总共包括了232个ECDNA+。
合成了针对编码CHK1基因的SGRNA模板寡聚物（集成的DNA技术），并与红色荧光蛋白（RFP）（cellecta-prsg16-u6-u6-u6-u6-u6-sg-hts6c-ubic-ubic-ubic-ubic-ubic-tagrfpp-2a-puro）相结合。购买了非靶向绿色荧光蛋白（GFP）（SGNT-GFP）质粒。
用SGCHK1-RFP或SGNT-GFP病毒转导ECDNA+和ECDNA- HELA细胞，并在2.5 µg mL-1下加入嘌呤霉素（Sigma），以进行48小时。在选择48小时（第0天）后，混合了表达SGCHK1-RFP或SGNT-GFP的相等数量的细胞，以获得RFP与GFP种群比率。在接下来的几天中，进行流式细胞仪分析以确定SGCHK1-RFP与SGNT-GFP比率。混合的细胞种群培养物保持在亚汇合。针对CHK1的SGRNA序列如下：
第17号：cctgacagctgtcactgggt
第18号：GCTGTCAGGAGTATTCTGAC
将样品裂解在补充蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Fisher Scientific，CatalogNo。784444）中，在补充蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Fisher Scientific，第78444444444444号）中裂解。用二氨酸酸测定法（Fisher Scientific，CatalogNo。23225）定量蛋白质浓度，并在4×样品缓冲液（Bio-Rad，CatalogNo。1610747）中制备样品。将样品加载并在4–12％的BIS-Tris梯度凝胶（Fisher Scientific，CatalogNo。WG1403Box）上运行，并转移到硝基纤维素膜上（Bio-Rad，CatalogNo。1704271）。将膜用Tris缓冲盐水中的5％BSA封闭，其中有补间（Fisher Scientific，CatalogNo。28360）持续一个小时，然后将原代抗体（1：1,000稀释）加入并在4°C下孵育过夜。初级抗体孵育后，将膜用Tris缓冲盐水与Tween洗涤，并与二抗孵育1小时。然后将膜与增强的化学发光试剂（Fisher Scientific，CatalogNo。32106）一起孵育，并对蛋白质荧光进行了图像采集。
使用Alphalisa Surefire Ultra P-CHK1（SER345）测定法（Perkin Elmer，Catalogno。Alsu-PCHK1-A10K）测量细胞中的复合活性。将HT29细胞培养在McCoy 5 A培养基中，该培养基具有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素，并播种至96孔板（Corning，CatalogNo。3599）。将化合物在10分剂量范围内以3倍稀释量在DMSO中连续稀释，并将化合物溶液添加到每个含有细胞的井中。将板以1,000 rpm离心30 s。将板在37°C下孵育16小时。通过将盘子甩在纸巾上，取出上清液。用PBS溶液洗涤井一次。将新鲜制备的裂解缓冲液添加到每个井中，并在400 rpm上在板振动机上搅拌板，持续30分钟。将96孔细胞板以1,500 rpm离心1分钟。将每个孔从10 µL的裂解物转移到384孔的光盘（Perkin Elmer，目录号6007290）中。添加了每个井的受体混合物（5 µL），并将板密封并用箔纸包裹。将板搅拌在板振杆上2分钟，然后在室温下孵育1小时。将供体混合物（5 µL）添加到每个孔中，并将板密封并用箔纸包裹。将板搅拌在板振杆上2分钟，然后在室温下孵育1小时。在设想多模板读取器（Perkin Elmer）上读取alphalisa信号。使用XLFIT（IDB）或GraphPad Prism（GraphPad软件）将数据拟合到剂量响应曲线中，以计算每种测试化合物的IC50值。
使用均质时间分辨荧光（HTRF）Kinease分析（Cisbio，CatalogNo。62ST1PEC）测量CHK1酶活性。全长人CHK1蛋白（GenBank登录号NP_001265.1）从Carna Biosciences，Inc。（目录号02-117）获得。在含有分析缓冲液（最终浓度）的测定缓冲液中进行酶反应：CHK1酶（0.012 ng µl -1），MGCL2（5 mM）和DTT（1 mm）。为了确定复合剂量响应，DMSO库存溶液以十分浓度序列串联以重复的方式稀释。将复合溶液（50 NL）添加到384孔测定板中（Greiner，目录编号784075）。向每个含有复合溶液的井添加了测定缓冲液（5 µL）。将板以1,000 rpm离心1分钟，然后在室温下孵育10分钟。该反应是通过添加含有（最终浓度）的底物缓冲液（每孔5 µL）的：STK底物1-生物素（120 nm）和ATP（1 mm）开始反应。将测定板以1,000 rpm离心1分钟，然后在室温下孵育60分钟。通过添加含有（最终浓度）的检测缓冲液（CISBIO，10 µL）来停止反应：STK抗体隐秘（0.25 nm）和链霉亲和素XL665（7.5 nm）。将板以1,000 rpm离心1分钟，然后在25°C下孵育2小时。HTRF信号在HTRF模式下的Envision Multimode Plate读取器（CISBIO）上读取。使用XLFIT（IDB）或PRISM（GraphPad软件）计算每个化合物测试的IC50值的数据适合剂量响应曲线。
光底96孔板（Thermo Scientific，CatalogNo。165305）用50 µL的1：1 poly-赖氨酸（R＆D Systems，CatalogNo。3438-100-01）和Poly-lysine（R＆D Systems（R＆D Systems，Catalogno。3439-100-01）涂层。用100 µL PBS（Gibco，CatalogNo。10010-023）将井洗一次，并将所有液体从井中取出，并在室温下完全干燥。在100 µL的罗斯威尔公园纪念研究所媒体（Thermo Fisher，目录No。22400089）中，将COLO320 ECDNA+细胞以每孔15,000个细胞接种，补充了10％FBS（Omega Scientific，CatalogNo。FB-01）。将细胞与37°C的孵化器连接在5％CO2过夜中。第二天，用BBI-825处理细胞16小时。治疗后，除去所有培养基，并在室温下用4％PFA（波士顿生物产品，目录NO。BM-155）固定细胞。固定后，除去4％PFA，并用100 µL PBS洗涤两次井。然后将细胞用100 µL的0.5％Triton X-100（Sigma-Aldrich，CatalogNo。T8787）在PBS中透化15分钟。通透性后，用100 µL PBS洗涤井两次，然后用5％山羊血清（ABCAM，目录，AB7481号）和1 mg ml-1的BSA（Geminibio，CatalogNo。700-100P）在房间温度下1 h。将初级抗体（磷酸-RPA32（S8）；细胞信号传导，目录编号54762）在阻塞缓冲液中稀释为1：200，将50 µL添加到所有井中，并在4°C下孵育过夜。然后将板用100 µL PBS洗涤3次，然后与1：1,000的二抗稀释（山羊抗兔IgG Alexa Fluor Plus 594; Thermo Fisher，CatalogNo。A32740S）和1：1,000 Hoechst 333342（catalog catalog，catalog，catalog at catalog at catalog at catalog at catalog，catalog，catalog at catalog a at catalog a at catalog，catalog a at catalog，catalog cat cat cat cat cate cat cat cate cat cat cat cat cat cat cat lote hote少1个。然后用100 µL PBS洗涤板3次； 最后洗涤后，将100 µL PBS留在井中。使用CellinSight CX7 LZR Pro高含量成像仪（Thermo Fisher Scientific）对板进行成像，并使用HCS Studio Cell分析软件（Thermo Fisher Scientific）上的点检测器生物应用模块分析了数据。使用细胞核内的像素阈值方法检测到点状，并且包含三个或更多点磷酸化的RPA32 Ser8染色的细胞被认为是正信号。
根据Charles River Accelerator and Development Lab（CRADL）机构动物护理和使用委员会批准的方案进行动物实验（协议No。EB17-010-066）。小鼠在12/12 h的光/黑暗周期中在单独通风的笼子中进行社会饲养，温度在65至75°F和30–50％的湿度之间。SNU16胃癌细胞系购自ATCC（目录号CRL5974），并在Roswell Park Memorial Institute Institute培养基（Gibco，CatalogNo。22400-089）中保存，并补充了10％FBS（Omega Scientific，Catalog，CatalogNo。FB-02）。为了建立肿瘤，通过皮下注射到9周大的女性严重的免疫缺陷小鼠（Envygigo，应变编码186）中，给出了200 µL PBS和Matrigel（Corning，CatalogNo。354234）的1×106 SNU16细胞（Corning，CatalogNo。354234）。每周进行两到三次肿瘤测量，每天进行体重。使用数字卡尺获得肿瘤体积测量，并使用肿瘤体积（MM3）使用公式：肿瘤体积=（L×W2）/2，其中L是长度/最大的肿瘤直径，W是宽度/最短肿瘤直径，所有肿瘤都收集到所有肿瘤，然后收集到1,500 mm3。Animals (eight mice per group, which historically allowed for significance determination between vehicle and infigratinib) were randomly assigned to unblinded treatment with vehicle, infigratinib (15 mg kg−1 oral (PO) once-daily (QD)), BBI-2779 (30 mg kg−1 PO every other day (Q2D)) or the combination of BBI-2779 and infigratinib once average tumour volume was285（±10）/平均值（±S.E.M。）MM3。在第22天将一种车辆肿瘤拆除；小鼠由于肿瘤体积较大而被处死。在乙酸钠缓冲液，pH 4.6和聚乙二醇300的1：1混合物中配制了杂酸300。BBI-2779在0.5％甲基纤维素（Sigma-Aldrich，catalogno。M0512）和0.2％Tween（Agscientific，tween，scientific，cocientic，cocientific，catalogno。M0512）中配制了BBI-2779。 目录号。T-2835）在分子生物学级水中（Hyclone，目录编号SH30538.02）。向单个动物提供了剂量假期，这些动物显示出比基线相比大于-10％的体重变化，并向整个治疗组提供了Nutra-Gel。最后剂量后6小时，24小时或36小时处死动物，并收集肿瘤进行蛋白质印迹或拷贝数分析。
为了进行拷贝数分析，将肿瘤切成10-20毫克的碎片，并在液氮中切成薄片。使用Qiacube DNA提取试剂盒提取DNA（Qiagen，第51331号）。简而言之，将缓冲液ATL和蛋白酶K的混合物添加到冷冻的肿瘤片中，并将它们置于平衡至室温上。然后将肿瘤涡旋30 s，并在56°C下放入孵化器中，以消化过夜。第二天早晨，加入另外150μl的缓冲液ATL，并将样品涡流为30 s，以降低样品的粘度，然后再转移到S块中。在其余的DNA分离中遵循96 Qiacube HT的QIAGEN方案。纯化的DNA在Qiaxpert（Qiagen，CatalogNo。9002340）上定量是否存在双链DNA。将DNA稀释至RNase/DNase无水（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。10977015）中的5 ng µl-1（5倍工作库存），并将2 µL加载到384孔板中。Master mix recipe (Master Mix (2×), 5.5 µl; CNA (Target Gene) 20×, 0.55 µl; CNR telomerase reverse transcriptase (TERT) 20×, 0.55 µl; nuclease-free water, 2.2 µl) was made containing TaqPath Pro Master Mix 2× (Thermo Fisher Scientific, catalogue no. A30866) human female genomic DNA（Promega，目录号G1521）作为参考，内部控制（人类TERT）和FGFR2或MYC目标基因探针（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。4400292）。使用QPCR反应设置如下：DENATURE/酶激活：95°C，10分钟；95°C，15 s的40个循环；退火/延伸60°C，60 s。
所有统计方法和样本量均在图传说或方法部分中说明。没有使用统计方法来预先确定样本量。默认测试类型是双面统计测试，除非文本中指示。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
