使用Fidelio聚合酶（Ozyme）进行所有PCR，并使用Gibson组装混合物（NEB或Codex）或T4 DNA连接酶（NEB）进行克隆。本研究中使用的所有POLθ构建体（GFP –POLθ）的外源表达是通过在PiggyBac CAG CAG EGFP载体（AddGene，＃40973）与BSRGI和SACI限制位点的CAG CAG eGFP载体（AddGene，＃40973）中的C端FLAG-P2A-Blast盒式融合来实现的。P2A-blast磁带是从Eflut P2A-Blast质粒（来自J. Stewart-ornstein的礼物）上放大的，带有含有标志序列的正向引物。对于Degron实验，将旗手盒从PMK288（Maid-BSR，Addgene 72826）中扩增，并融合到P2A-Blast中并克隆在Piggybac Cag Cag EGFP-Polq中。使用逆转录病毒载体：PBABE BLAST OSTIR1-9MYC（ADDGENE 80073）实现TIR1表达。通过扩增将DNA片段（来自综合DNA技术的GBLOCKS）克隆到PiggyBac CAG CAG EGFP-POLQ-POLQ-POLQ-PLAG-P2A-BLAST中，可以在PFLFI和NHEI限制性位点之间克隆到PiggyBac CAG eGFPP-POLQ-PLAG-P2A-BLAST中获得Polθ（10a）和polθ（4a）。为了进行敲门实验，获得了ki-polq-e30-纽约盒用于POLQ敲入，并获得了旗手杀菌素和旗帜涂层的墨西哥cassettes，在组装PCR片段后，获得了BRCA2敲入，以扩增Mneongreen Plasmid（来自D. Fachinetti）的PCR片段（PMKAINETTI），PMK288（MAID），PMKK288（MAI）和PMK287（aid-Hygro，Addgene 72825）质粒。用600 bp的同源序列在POLQ和BRCA2的最后一个外显子中进行了PCR，最后在PUC19载体中克隆。POZ-53BP1WT和POZ-53BP1AA（包含T1609A/S1618A突变）质粒是D. Chowdhury的礼物。允许细菌表达他的– TOPBP1 BRCT0-2，GST – TOPBP1 BRCT4-5和GST-TOPBP1 BRCT7-8的质粒是J. N. Mark Glover的礼物。
我们使用了HTERT-RPE-1（人视网膜上皮），HEK-293T（人类胚胎肾）和HeLa（人宫颈腺癌）细胞。所有细胞系均从ATCC获得，并在Dulbecco修饰的Eagle培养基（DMEM）中生长，含有营养混合物F12（用于RPE-1）或DMEM（用于HEK和HELA）（GIBCO）（GIBCO），并补充10％胎儿小腿血清（FCS），2 mm Glutamine和200 IU Ml-lutamine和200 Iu ml-ml-1 Penicillin。将细胞在5％CO2中在37°C下孵育。在整个过程中，野生型GFP –Polθ是指在RPE-1 TP53 - / - ; polq - / - 细胞中GFP-Polθ的外源表达，BRCA2 - / - GFPPP-POLθ是指RPE-1 TP53 tp53-tp53-pol-pol-polpoLIN的外源表达的brca2 - / - gfpP-polθ。当在HELA或HEK-293T中进行实验时，图中指定了细胞系来源。根据制造商的说明，使用转座酶（系统生物科学，PB210PA-1）将GFP-POLθ进行CO转染后获得GFP –POLθ的表达，并根据制造商的指示进行了选择。
所有基因组编辑的实验均使用由重组链球菌Cas9核酸酶，Alt-R CRISPR – CAS9 CRRRNA RNA（CRRNA）和反式激活CRRNA（tRACRRA）（tracrrna）组成的核糖蛋白（RNP）复合物（RNP）复合物（Integrated DNA技术1081058和1072532）。使用Rnaimax（Thermofisher Scientific）用RNP复合物转染后获得敲除细胞系。先前描述了RPE-1 TP53 - / - 野生型和等源性BRCA2 - / - 或POLQ - / - 细胞系26。
敲除细胞系如下：BRCA2 - / - GFP -POLθ细胞是通过在POLQ - / - 细胞中与GFP -Polθ互补的POLQ - / - 细胞中产生的。为了产生表达GFP-Polθ-MAID的BRCA2 - / - 细胞，首先在BRCA2 - / - 细胞中引入GFP-Polθ-MAID，然后将POLQ拆除。转染RNP复合物靶向内含子侧面外部2（BRCA2-KO1：GGTAAAACTCAGAAGCGC; BRCA2-KO2：GCAACACTGTGACGTACT）后，获得了BRCA2基因的敲除。转染RNP复合物靶向内含子侧面外侧面exon2后，获得了POLQ基因的敲除（POLQ-KO1：GGAAGGCTTTTTTAGGTCAGTA； POLQ-KO2：GGCAACGGGGGGCAGCTCCCGC）。表示TIR1（Addgene 80073）表示在IAA处理后允许polθ降解。
To generate knock-in cell lines, cells were co-transfected with cassettes (Flag-NeonGreen-mAID-BLAST for POLQ knock-in, Flag-mAID-Zeocin and Flag-mAID-Hygromycin for BRCA2 knock-in) and RNP complexes (POLQ-KI: GTGAAAATAGGCGCCAGC; BRCA2-KI: GGAGAGTTCCCAGGCCAGTA).接下来，在适当的抗生素中选择细胞2周，并将抗性种群取代在96井板中。克隆通过PCR筛选。
Retroviral particles containing either TIR1, pOZ-53BP1WT or pOZ-53BP1AA plasmids were obtained by transfection of the retroviral vectors with an expression vector for the VSV-G envelope protein (Addgene, #8454) into HEK-293T cells expressing GAG-pol proteins (Phoenix cells) using LTX (ThermoFisher Scientific).在细胞转导之前收集并过滤含有上清液的病毒颗粒。
通过转染MCHERRY-PCNA-SV40NLS-4质粒（Addgene，＃55117），抗生素选择（Neomycin）和细胞分选（MCHERRY），通过将MCHERRY-PCNA-SV40NLS-4质粒转染了随机整合后产生表达MCHERRY – PCNA的细胞系。Blasticidin (HEK and HeLa: 5 μg ml−1, RPE-1: 21 μg ml−1), puromycin (HEK: 5 μg ml−1, HeLa: 1 μg ml−1, RPE-1: 21 μg ml−1), zeocin (HeLa: 600 μg ml−1), neomycin (RPE-1: 600 μg ml−1)在指定的浓度下，使用杂菌素（500μgml -1）进行细胞系选择。细胞系已通过短串联重复（STR）分析（EUROFIN）正确识别，并每月通过qPCR进行支原体（EUROFINS）测试。
Nocodazole（100 ng ml-1，Sigma），3- indoleaceticac（IAA，500μM，Sigma），RO3306（称为CDKI，5μM，Sigma），蚜虫蛋白（0.4μm至1.6μm，Abcam，Abcam），sir-dna（sir-dna）（250 nmmmcopedy）微辐照实验，螺旋色体），ATRI（2.5μm，SelleckChem，VE-821），ATMI（10μm，Tocris，ku-55933），palbociclib（1μmPLK1I遍布200 nm，SelleckChem，BI6727），BI2536（200 nm，SelleckChem），MG132（10μM，Sigma），Bleyomycin（50μgml -1，Sigma，Sigma，b7216），Polθi（Novobiociatiation）（Novobiociatiation in Novobiocin，200μmmmmmma，sigmma，sigmma，sigmma，Sigmma，Sigmma）均使用。
For RNA interference, we used the following targeted sequences targeting MDC1 (GUCUCCCAGAAGACAGUGAdTdT), TOPBP1 (ACAAAUACAUGGCUGGUUAdTdT), BRCA2 (GAAGAAUGCAGGUUUAAUAdTdT), BRCA1 (CAGCAGUUUAUUACUCACUAAdTdT), FANCD2（ggauugaugaugguauggucuacuatdt），53bp1（caggacaguuuccacgadttttttt）和lacz（控制，cguacgcggaauacuucgadttttttt）。按照制造商的说明，使用Lipofectamine Rnaimax（Thermofisher Scientific）对siRNA寡核苷酸（EUROFINS）进行转染。
对于蛋白质印迹，本研究中使用的抗体购自Millipore（BRCA1 OP92; BRCA2 OP95），Sigma，Sigma（抗磷酸/Thr-ser/thr-Pro MPM2 05-36849; anti-Pan-phospho-shos-ser-phospho-ser-ser-ser-sab5700550，sab5700550，par actaction a5316）SC-74559），ABCAM（DNA连接酶III AB185815; MDC1 AB11171），细胞信号（他的2365），ABCLONAL（PAN-PHOSPHO-SER/THR抗体，AP0893）和Bethyl（EXO1 A302-639A，TOPBBP1 A39A，topbp1 a39a，topbp1 a39a，topbp1 a39a a39a a39a a39a a39a a39a）。Polθ抗体是J. S. Hoffmann的礼物。对于免疫荧光，购买抗体是从Institut Curie抗体平台（HA），免疫电视（Crest HCT-0100），Chromotek（Mneongreen 32F6），Novus Biologicals（FANCD2 NB100-182），Bethyl Laboratories（H2A.XA.X（H2A.X）（ser1139）a3001 AA;ABCAM（MDC1 AB50003; 53BP1 AB21083），Millipore（H2A.X（SER139）05-636; Phospho-Histone H3（Ser10）06-570; 53BP1 MAB3802），以及Santa Cruz Cruz Biotechnologic（cyclin a scclin a sc-272; cyclinology a sc-272;SC-5504）。Eurogentec使用以下磷酸肽：LLFDPSFSDDYLV生成了兔磷酸化特异性抗体血清（PS1493）。
激光微辐照在800 nm处使用两光片：Saphire Laser（Mai Tai DeepSee，Spectra Physics），在倒置的激光扫描scaning scaning Commoscope上具有20％的功率（从2.1 w），配备了光谱和多光谱仪（lasser zer ze sepocal sepocal secop of Specopal and sepssee and spectra sepsee and spectra sepsee and spectra insics）。物理学），使用40×物镜Na1.3油DICII PL APO（420852-9870）。使用斐济（版本2.1.0/1.53C）的“图z轴轮廓”函数分析图像。使用CIXD双辐照器（Radexp平台，Institut Curie）进行X射线辐照。
所有免疫印迹和免疫沉淀实验均通过核提取物进行。用细胞核提取缓冲液裂解（10 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl，1.5 mM MGCL2、34毫米蔗糖，10％甘油，1 mM Dithiothreitol（dtt），0.1％Triton X-100）之后，获得了细胞核。将裂解物在冰上孵育5分钟，并在1,300克离心5分钟。将核（颗粒）在300 mM RIPA裂解缓冲液中裂解（300 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.5、0.2 mm EDTA，pH 8.0和1％NP-40）在冰上40分钟，在冰上，苯并酶（Sigma）（Sigma）在最终10分钟内添加。将提取物在20,000g下离心20分钟，并使用BCA试剂盒（Thermofisher Scientific）确定蛋白质浓度。对于免疫沉淀实验，将1 mg的蛋白质提取物在150 mM NaCl RIPA缓冲液中稀释至1 mg ml-1，并与磁琼脂糖珠（Chromotek，GFP Trap（GTMA-20），MneongReen-Trap（NTMA-20）孵育2 h，在4°C下，均与磁琼脂糖珠（Chromotek，GFP Trap（GTMA-20），Mneongreen-Trap（NTMA-20）。在洗脱之前，将珠子用150毫米NACL RIPA缓冲液洗涤两次，一次用300 mM NaCl RIPA缓冲液洗涤。所有缓冲液均补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Phosstop和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Roche）。最后，通过Nupage Tris-乙酸凝胶（4/8％，Invitrogen）解决裂解物，并转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad）（10％Tris-甘氨酸中的湿转移，20％甲醇，0.05％SDS中的湿转移，40 V）。然后将膜在5％牛奶或10％BSA中阻塞1小时，并与所需抗体杂交。
使用PET-22B表达载体作为具有C-末端GB1蛋白TAG的融合蛋白和6倍他的标签，使用PERθ蛋白片段（E1424 – Q1503）和（E1540 – S1660）表示。在Polθ蛋白片段和GB1之间引入了TEV位点。优化了polθ基因片段，并通过Genscript合成细菌中的高级表达。在NMR研究中，在15n标记和15N标记的polθ样品中，在大肠杆菌BL21（DE3）的恒星细胞中生长在M9的最小培养基中，其中含有15N标记的样品的15NH4CL的0.5 g L-1的15NH4CL或0.5 g L-1的15NH4CL和2 g l-l-l-lab-lab lab-lab-lab-lab lab/flab-lab lab lab/flab。在600 nm（OD600）为0.6的光密度下用0.5 mM IPTG诱导表达，并在37°C下孵育3小时。离心后，将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液（TBS 1×，无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Roche）中，并通过超声处理均质。在室温下用苯酶核酸酶和MGCL2（5 mm）处理裂解液，然后在4°C下离心（15,000g）20分钟。过滤上清液（0.44 µm），并在Histrap HP 5 mL柱（GE Healthcare）上以2 ml min -1的量加载，该柱与缓冲液A（TBS 1×1×，20 mM咪唑）平衡。使用咪唑的线性梯度（30分钟达到缓冲液B：TBS 1×1×，500 mM咪唑500 mM），以1 mL min -1洗脱蛋白质。将感兴趣的洗脱部分合并，并用TBS 1×将其稀释至1 mg ml-1，然后在4°C在4°C的TBS 1×1×1倍的过夜透析期间，将TEV蛋白酶（2％w/w）切割为GB1-6×His TAG。将切割的蛋白质溶液加载在Histrap HP 5 mL（GE Healthcare）柱上，并在没有GB1-6×的POLθ上收集了他的片段。通过SDS -PAGE分析纯化蛋白的质量，并使用其吸光度在280 nm处确定蛋白质浓度。
对于NMR研究，将样品透析针对NMR缓冲液（25 mM HEPES，50 mM NaCl，pH 7），并在15n标记的样品中以PLK1监测磷酸化的15n标记样品，以100-150μm的浓度浓缩实验。PLK1样品由Curie研究所的蛋白质生产设施提供。
为了监测与TOPBP1 BRCT7-8的结合，将磷酸化的15N标记的Polθ（E1424 – Q1503）的样品稀释至60-70 µm，并针对NMR缓冲液透析。使用NMR缓冲液将其进一步稀释，以便获得具有游离肽的参考NMR样品，或者用纯化的TOPBP1 BRCT7-8（POLθE1424– Q1503：TopBP1 BRCT7-8比率1：0.5）的溶液以相同的缓冲液以获得NMR样品的相同缓冲液，以获得含有限制性的限制样品。
NMR实验是在polθ蛋白片段（E1424 – Q1503）和（E1540 – S1660）上进行的，要么15N-或15N，13C标记，并溶解在NMR缓冲液中（另外还有7％V/V/V/V/V/V/V D2O和EDTA-FREE无蛋白酶蛋白酶抑制剂）。大多数实验记录在配备三重共振的低温冷却探针的700 MHz Bruker Advance NEO光谱仪上。1HN，13Cα，13Cβ，13cβ，13C和15N共振频率在283 K下使用2d 1H – 15n Sofast HMQC，3D HNCA，3D HNCACB，3D HNCACB，3D CBCA（3D CBCA）（CO）NH，3D HNCO，3D HNCO，3D HNCO，3D HN（CA）和3D HN（CA和3D HN）（CA）CO）（CA）。使用非均匀采样（NUS：40–50％）记录所有3D实验。为了通过PLK1监测磷酸化，将15n或15n的13c标记的polθ蛋白片段与PLK1混合，并在8小时内记录了一系列16 2d NMR 1H-15N SOFAST HMQC实验，在8小时内，在298 k中记录了每个实验，每个实验均为1,536×160个数据集中在30分钟内获得30分钟的30分钟。然后将温度设置为283 K和2d 1h – 15n Sofast HMQC，3D HNCA，3D HNCACB，3D CBCA（CO）NH和3D HN（CA）NNH实验，以便为了分配磷酸化的片段的共振频率，以分配磷酸化的片段的共振频率（同时为40-50％）。对于polθ（E1424 – Q1503）片段，在磷酸化动力学的两个不同阶段进行了共振分配，首先在与PLK1的1：200比例孵育后首先，第二次与PLK1的1：200和1：1：1：1：1：150之后进行第二次孵育。对于Polθ（E1540 – S1660）片段，在与PLK1的1：200比率孵育后进行了共振分配。
在polθ蛋白片段F1中识别TOPBP1 BRCT7-8结合位点，在15n标记的polθ（E1424-Q1503）片段上记录了2d 1h – 15n HSQC实验，无论是磷酸化是否在1：1：1.0.5的情况下，磷酸化或没有磷酸化或没有磷酸化的片段，或者存在。数据集在5小时内采用800扫描。使用Topspin 3.6（Bruker）处理数据，并使用CCPNMR分析软件进行分析。51。1H，13Cα，13Cβ，13Cβ和15N的共振分配（E1424 – Q1503）和（E1540 – S1660）在生物磁共振数据库（BMRB）中沉积在无磁值和51939的生物磁共振数据库（BMRB）中，用于非平移和51920的51920。形式分别。
使用链霉亲和素生物传感器上的BLI技术（fortébio）上的BLI技术测量了polθ肽与TOPBP1 BRCT7-8之间的生物分子相互作用。通过与N末端生物素合成polθ肽（E1472 – Y1498）。肽序列是（PS为磷酸化的丝氨酸）：4S-P：Biotin-GSG-EgenlPvPetpslnmpsdpslnmpsdpslfdpsfdpsfsddy和4S：Biotin-GSG-EgenlPvpetslnmsdslnmsdslfdsfddy。将生物传感器在TOPBP1 BRCT7-8缓冲液（25 mM HEPES，50 mM NaCl，5 mMβ-甲醇）中进行水合20分钟。TOPBP1 BRCT7-8与生物传感器之间的非特异性相互作用是通过执行结合测定而不将生物素化肽加载到链霉亲和素生物传感器上的情况的。在这些条件下，未观察到相互作用。对于结合测定，使用5μM的生物素化肽浓度将其连接到链霉亲和素传感器上，并以不同的浓度（62.5-2,000 nm范围为4S和7.8-500 nm范围为4s-s-p）添加TOPBBP1 BRCT7-8。在每个动力学实验之前，都进行了3次孵育的3个循环。在稳态模式下测量KD值。
GFP –Polθ（4°C时2小时GFP诱捕物，然后用150 mm NaCl缓冲液洗涤2小时，用300 mm NaCl洗涤2次）或1.2μgRBER-CDC25TIDE（反应生物学，0590-0000-100）在30μLKINSASE中溶于30μLKINSASE，将1.2μgRber-CDC25TIDE（反应生物学溶于300毫米）洗涤2次，将1.2μgrber-cdc25tide（反应生物学恢复），将1.2μg（rber-cdc25t）洗涤1次，将1.2μg（在400 mm naCl）洗涤时500 ng重组PLK1（反应生物学，0183-0000-1）和5μMATP和5μCI[γ-32P] ATP。在30°C下孵育30分钟后，通过添加2×Laemmli缓冲液在冰上停止反应，并在95°C下煮沸5分钟。在4–8％的三乙酸凝胶（或CDC25阳性对照的10％SDS-PAGE）上分离样品，并通过放射自显影检测到磷酸化的32P-POLθ和CDC25。
另外，在PET-28（B+）载体中克隆的POLθ（E1424至Q1503）片段（genscript）上进行了体外磷酸化测定。简而言之，3μM的polθ片段（E1424至Q1503）或RBER-CDC25TIDE（PLK1底物用作阳性对照，从反应生物学，0590-0000-1获得。cdc25序列是：isDATATFADFADQAEK; isDATFADFADFADQAEK; iSdATFADFADMIND in plosm indem pl; pl;PLK1 enzyme (Reaction Biology, 0183-0000-1) in 20 μl of kinase buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM β-glycerophosphate, 2 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4, 10 mM MgCl2) (Abcam) and 0.2 mM ATP for 2 hours at 30 °C.将反应加载到丙烯酰胺凝胶上，其中使用Pro-Q钻石磷酸蛋白印迹染色剂（Thermofisher Scientific，p33356）检测到磷酸化的蛋白质，并使用Sypro Ruby蛋白凝胶染色（Thermofisher Scientific，S12000）使用Sypro Ruby蛋白（使用Chanductions）进行了（BioREDIONS）（BIOR SYSTIONS）（BIOR shandions）（BIOR启示）（BIOR启示）（BIOR）（BIOR）（BIOR）（BIOL）（BIOR）（BIOR）（BIOR）（BIOR）（BIOR）揭示了（BIOR）。
将TOPBP1片段（1-290）（也称为TopBp1 BRCT0-2）克隆到PET-22B质粒（Genscript）中。使用PGEX-6P-1质粒提供了J. N. N. Mark Mark Glover 52,53。BRCT0-2片段包含一个8-HIS N末端标签，BRCT4-5和BRCT7-8 a GST标签。所有BRCT域都包含TEV切割站点。Plasmids coding for TOPBP1 BRCT domains 0-2, 4-5, and 7-8 were transfected into E. coli BL21 (DE3) Star cells (Thermo Scientific, EC0114) grown at 37 °C up to an OD600 of 0.7, induced with 0.2 mM isopropyl-β--thiogalactopyranoside (IPTG) and incubated at 22 °C overnight (16 h).通过离心收集细胞培养物，并将其重悬于25 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl，5 mM DTT和10％甘油中。如所述52,53，进一步纯化了蛋白质。通过使用其（BRCT0-2）或GST（BRCT4-5和BRCT7-8）抗体进行免疫印迹证实了TOPBP1 BRCT结构域的表达。
含有所需磷酸化丝氨酸的生物素化polθ肽购自GeneCust（4S和4S-P; S1628/S1635和S1628-P/S1635-P），并以0.5至2 mg ML-1的浓度重悬于水中，并根据制造商的指示。将肽偶联到旋转轮的150毫米NaCl中的链霉亲和蛋白珠，持续1小时。在使用下拉测定之前，将珠子用150毫米NaCl洗涤两次。将HELA细胞（350μg）或2 mL细菌蛋白提取物中的核提取物与1 nmol的所需链霉亲和蛋白珠偶联的肽，在旋转轮上，在室温下2小时孵育。孵育后，使用150 mM NaCl RIPA缓冲液洗涤珠3次，并使用300毫米NaCl在2×Laemmli缓冲液中洗脱前两次使用珠。所有使用的缓冲液均补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂。通过SDS -PAGE分析洗脱蛋白，以鉴定肽伴侣。将相同数量的用于下拉的肽加载到一个单独的凝胶中，并在迁移方面检测到生物素信号。肽序列是（PS为磷酸化的丝氨酸）：4S-P（1482/86/88/93）：Biotin-GSG-EGENLPVPETPSLNMPSLNMPSDPSDPSLFDPSFSDDY。4S（1482/86/88/93）：biotin-gsg-egenlpvpetslnmsdslnmsdslfdsfsfsddys。1628-P/S1635-P：Biotin-GSGTRQNHPSFIWSGAPSFDLSPGLQRILDKVSS。S1628/S1635：Biotin-gsgtrqnhsfiwsgasfdlspglqrildkvs。
为了通过质谱鉴定POLθ结合伙伴，如上所述，在HEK-293T Neongreen-Polq敲击细胞的5 mg核提取物中进行了POLθ免疫沉淀。将裂解液与绿色捕集磁琼脂糖珠（Chromotek）在4°C下孵育2小时，并用150 mm NaCl缓冲液洗涤两次，一次用300 mm NaCl和25 mm碳酸氢盐的300 mm NaCl和3次洗涤。最后，将珠重悬于100 µL 25 mm碳酸氢铵中，并通过在37°C下添加0.2μg胰蛋白酶/LYSC（promega）消化1小时。然后将样品加载到定制的C18 stagetips中，该Stagetips通过将一个吸引人的磁盘（Spe-Disks-bio-c18-100.47.20 affinisep）和2 mg珠（186004521 Seppak C18 c18 cartridge cartridge Waters）堆叠到200 µl微管tip中，以使其达到200 µl微管尖端。使用40:60 MECN的比率洗脱肽：H2O + 0.1％甲酸和浓缩到干性的真空。通过使用RSLCNANO System（最终3000，Thermo Scientific）与Orbitrap Exploris 480质谱仪（热科学科学）耦合，在液相色谱 - tandem质谱法（LC -MS/MS）分析之前，在注射缓冲液（0.3％TFA）中重组肽。在三个独立的实验上进行了质谱分析。Neongreen-trap磁琼脂糖珠在HEK本地细胞提取物中孵育。对于通过质谱法鉴定的polθ磷酸化位点，在诺科唑中将表达GFP -POLθ的HELA细胞阻塞16小时。在Nocodazole治疗的最后一个小时中添加了DMSO或伏拉替伯。将5毫克的核提取物与GFP捕获磁磁琼脂糖珠（Chromotek）在4°C下孵育2小时，并用150 mM NaCl缓冲液洗涤一次，用300 mm NaCl和500 mm NaCl缓冲液洗涤两次。最后，将珠重悬于100 µL 25 mm碳酸氢铵中，并通过添加0.2μg胰蛋白酶/LYSC（Promega）消化。 在37°C下持续1小时。然后将样品脱盐，并在LC -MS/MS分析之前在注射缓冲液中重构，如POLθ结合伴侣鉴定中所述。对五个独立的实验进行了质谱分析。GFP陷阱磁琼脂糖珠在HeLa天然细胞提取物中孵育用作对照。对于质谱法（4S和4S-P）结合伴侣通过质谱鉴定的polθ肽，在HELA细胞的666μg核提取物中进行了肽下拉。将裂解物与链霉亲和蛋白珠耦合肽一起在室温下旋转车轮2小时孵育2小时。孵育后，使用150 mm NaCl缓冲液洗涤珠3次，并使用300 mm NaCl洗涤两次。重悬，消化和脱盐，然后在LC – MS/MS分析之前重新构成肽，如Polθ结合伙伴识别所述，并使用Orbitrap Eclipse质谱仪。对五个独立的实验进行了质谱分析。在HeLa细胞的核提取物中孵育的链霉亲和蛋白珠的下拉用作对照。
质谱法蛋白质组学数据已通过pride55 pride55合作库与数据集识别器PXD02029585（excieper_pxd029585 extunignibing tocarding，prolightifier pride55 prolightifier_pxd029585 extuneby，protifier pride55合作伙伴和项目加入：PXD036486（用户名：Reviewer_pxd036486@ebi.ac.uk，密码，密码：GQEYLT33），用于polθ磷酸化站点量化和项目登录：PXD042167（exighter_pxd042167）4S-P绑定伙伴识别。
每个条件将细胞铺在4×10 cm的菜肴中，并通过与诺科唑隔夜处理同步。接下来，通过摇动，离心并计数来收集有丝分裂细胞。将25万个有丝分裂细胞铺在1 ml含培养基的1 mL诺辅唑中，并用RNP复合物转染，该复合物的靶向位于19号染色体上的两个AAVS1基因座之一（AAVS1 GRNA基因座1：TGTGGCCTGGGTCACCTCTA；在室温下与8.4 pmol退火的crrna – tracrrna在室温下共孵育7 pmol的Cas9，总体积为100 µL Opti-MEM 10分钟。然后将rnaimax（4 µL）添加到混合物中，并在孵育5分钟后转染细胞。转染后七个小时，将细胞颗粒，并使用核素组织试剂盒（Macherey-Nagel）进行基因组DNA提取。将一部分有丝分裂细胞用于磷酸含量H3（SER10）免疫染色。休息时间周围的PCR是使用Terra聚合酶（Takara）（30个周期：95°C 10 s，59°C 20 S，68°C 20 s）（基因座1：for2bp gaggacatcacgtggtggcagGGTGTGTCACCAGAGAGGAATCTGC，REV8BP GAGCTGGGACCCCTTATATTATTCC）。使用Nucleospin PCR清理试剂盒（Macherey-Nagel）将PCR产物用HPHI（25 U最终）（NEB）（NEB）消化2小时，并将其连接到PCR4载体（4 µL每次连接的PCR）（TOPO-TA克隆套件）（TOPO-TA克隆套件，Thermofisher Scientific），随后将其转化为NEB5细菌（TORMEB5 BACIRIA）。使用T7或T3底漆（Eurofins）对菌落进行Sanger测序。分析排除了缺少一个或两个引物序列和/或保留HPHI切割位点的维修产品。使用GGPLOT2将数据绘制在R中。
为了评估有丝分裂的末端连接修复，如前所述29，设计了DNA修复底物，以模拟包含四个微观学的DNA末端，该末端包含四个微观学。修复底物是通过将PCR产物（GFP序列）连接到两侧DNA寡核苷酸双链体来构建的。The PCR product (747 bp) was amplified from a GFP sequence (PCAG vector, Addgene) using the following oligonucleotide sequences (Fwd core GFP: CAAGTGGTCTCAGACTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG, Rev core GFP: GCCGAGGTCTCCGTCAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG), digested by theBSAI-HF V2酶（NEB）揭示了与DNA寡核苷酸双链体互补的4个核苷酸（NTS），最后是纯化的（凝胶和PCR清洁套件Macherey-Nagel）。同时，在以下寡核苷酸退火（95°C 10分钟，25°C 30分钟）退火（95°C 10分钟，25°C 30分钟）后，进行了两个寡核苷酸双链体（1和2）。双链1的寡核苷酸（17 nt dsDNA，69 nt ssDNA）：寡核苷酸1-A，catcgcttagctgtata;Oligo 1-B，tgactatacagctaagcgatgctctccagcgagcgtatctgctggg ttgtggatggatgaatgaattaCataTaTaCatgctggGagaCaaCcaagattgggCagttt。双链2（15 NT DSDNA，71 NT ssDNA）的寡核苷酸：Oligo 2-A，ctcacaccccatctca;Oligo 2-B：agtctgagatgggtgtgtgtgatgagtgaagatcctcactccttcggagtactcttctttttgaccattgaccattgatacgatacttcttctcagccgagagctgctt。
使用T7连接酶（NEB）将寡核苷酸双链1和双链2（每个100 pmol的100 pmol）连接到核心GFP PCR（10 PMOL）。然后将所得的双链1 – GFP –链体2 DNA片段磷酸化（多核苷酸激酶，NEB）并纯化（Nucleospin PCR清理，Macherey-Nagel）。在细胞中，两个双链1 – GFP –链体2个DNA片段可以通过序列微型学（寡核苷酸序列中的大胆的四个核苷酸）进行退火，从而形成DNA末端加入修复产物。
使用Rnaimax试剂用150 ng的双链1 – GFP – DOPLEX 2底物转染细胞（相间或有丝分裂），并孵育1.5 h。然后将细胞收集，离心，并重悬于2 mL苯并酶缓冲液中（50 mM Tris-HCl，1 mM MGCL2，25 U苯甲酶），在有丝分裂细胞中添加诺唑唑，并在37°C下孵育30分钟以去除细胞外DNA。使用Nucleospin组织试剂盒（Macherey-Nagel）纯化DNA。
为了测量DNA修复效率，在GFP序列（控制DNA修复底物转染）和潜在的最终连接维修产品上都进行了QPCR。使用SYBR Green Master Mix（Thermofisher Scientific）在GFP QPCR和最终加入QPCR之间，使用ΔΔCT（Thermofisher Scientific）计算有丝分裂的最终结合修复效率。
用于QPCR的引物。GFP：对于QPCR核心，ctcacacccatctcagactgtgagcaa;Rev QPCR GFP，cagcttgccgtaggtggcatcg。结束加入：用于qpcr eJ，gggttgtggatgaattaCatatgctgg;Rev QPCR EJ，CGGAGTACTCCTTTTTGACCATTGATAC。
所有寡核苷酸和底漆均从Eurofins订购。
在2％多聚甲醛中固定在盖玻片上生长的细胞15分钟，在0.5％Triton X-100中透化10分钟，在BSA 5％中阻塞30分钟，0.1％Triton X-100，免疫染色，用高级抗体（45分钟）进行了1 h的免疫抗体（高度跨加速抗体）（高度跨加速度）。安装的Vectashield安装介质包含DAPI（矢量实验室）。固定前使用cytospin离心机（400g，5分钟）通过摇动并在载玻片上离心，将相同的方案应用于有丝分裂细胞。为了用PCNA或TOPBP1抗体染色，在阻塞和免疫染色之前，将细胞用冰冷的甲醇固定20分钟。固定和通透性后，通过与Picolyl Biotin，CusO4，Cuso4，Thpta（Jena Bioscience）和PBS中的PBS中的pbs中的混合物孵育30分钟，在黑暗中以链霉亲和素conjugatin conjugatin conjugatin conjugation conjugation 647 Antibe孵育30分钟，在PBS中进行30分钟，在PBS中进行30分钟，在PBS中进行30分钟，在PBS中进行30分钟，在PBS中进行了30分钟，对生物素叠氮化的点击反应进行了反应。使用直立旋转磁盘共聚焦显微镜（Roper/Zeiss）或使用Deltavision（Deonvolution）图像恢复显微镜以60×或100倍的放大倍率拍摄图像。所有图像均以0.4μm的Z-stack在8μm的范围内拍摄，并使用最大强度投影预测。使用斐济软件56分析图像。除非另有说明，否则所有比例尺代表5μm。
人类DDR siRNA库，包括1,746个siRNA，代表582个人类基因（每个基因3个siRNA），从Thermofisher Scientific（A30089）获得。对于对照组，靶向GL2，驱动蛋白家族成员11（KIF11）和GM130的siRNA用于评估转染功效和诱导细胞毒性。FANCD2 siRNA (GGAGAUUGAUGGUCUACUATdT, defined as FANCD2-ctrl in Supplementary Table 1) was used as a positive control inhibiting Polθ foci formation.将表达GFP –Polθ的RPE-1细胞（384孔板中的每孔250个细胞）过夜。将siRNA与0.05μl干扰素试剂（多倍转染）和Opti-MEM（Thermofisher Scientific）一起孵育15分钟，然后再转移到每个384孔板孔中，以获得10 nm的最终浓度。转染后72 h辐照细胞，在5 Gy（226 s）的剂量下，用CIXD辐照器（Radexp Platform，Institut Curie）在37°C下孵育2 h，持续2 h。用MAP-C（Titertek）（Titertek）将细胞固定在3％多聚甲醛溶液（Sigma-Aldrich，HT5014）中15分钟，以1×PBS洗涤一次，并在50 mM NH4CL溶液中淬灭10分钟。然后用1％BSA溶液阻止细胞15分钟，并用0.5％Triton X-100透化5分钟。用0.2μgml -1 Hoechst 33342染色（DNA标记，1：500，Sigma，14533）。使用Incell Analyzer 6500 HS自动化系统（GE Healthcare）进行40倍放大倍数（Nikon 40×/0.95，PLAN APO）进行图像采集，并使用实验中所有板的相同曝光时间和跨复制实验进行相同的曝光时间。用Kinedx机器人臂（PAA）将板加载到Incell系统上。获取了每个井中六个字段的16位图像，每个井中包含HOECHST 33242（DAPI，WAVE 1）的通道和内在的GFP-Polθ（FITC，Wave 2）。使用Incell Analyzer 3.7工作站软件（GE Healthcare）进行计算图像处理操作。然后将polθ鉴定为核区域中的细胞器，并通过定义细胞器区域内像素的平均强度进行量化。将二进制阈值应用于至少含有5个polθ灶中的至少含有“％细胞多环境”的细胞（补充表1）。对于所描述的应用细胞阈值所描绘的每个特征或表型类别，使用Tukey的双向中间抛光57,58校正了板位的位置效应57,58，它迭代地减去了行，柱，柱和良好的中位数在复制中计算出的所有板。校正值被归一化如下：根据每个内部板块数据点的干涉蛋白处理的人群（称为REF POP）的样本中值和中值绝对偏差（MAD），并用于计算强大的Z-SCORES59（RZ分数），根据公式：RZ分数：RZ分数=（Compound Value - 中位数（参考人群）/（参考人群）/（参考人群）/（1.148888888888888888888888888888888888888888888888888）×MAD（参考）。如果化合物值对应于治疗良好，MAD定义为与干扰素治疗种群中位数的绝对偏差的中位数。如果| rz得分|在至少2个重复实验中，至少有2个针对相同基因的siRNA的相同方向上的> 2点。屏幕以三个生物学重复完成。对于每个siRNA，这三个重复实验中的每一个的中间RZ得分如图1a所示。
To determine Polθ foci formation during cell cycle progression, cells expressing GFP–Polθ and PCNA-mCherry were plated on 35 mm Ibidi μ-Dishes (Ibidi, 81156) and imaged every 10 min for 16 h on an Inverted Eclipse Ti-E (Nikon) microscope equipped with a stage-top incubator and CO2 delivery system, 40× (1.4 NA) oil objective, a Spinning disk配备摄像机EMCCD的Gataca系统集成在metamorph软件中的横川CSU-X1单元。图像安装在软沃尔克斯中，并使用斐济软件（1.53C）进行分析。蚜虫素（除非另有说明，否则1.6μm）在获取前3小时将其添加到细胞中24小时。对于核体解决方案，在开始获取之前30分钟添加了palbociclib。
为了确定通过相位对比的视频显微镜确定有丝分裂的时机，将250,000个细胞在成像前24小时以35 mMibidiμ-曲线（Ibidi，81156）播种。在成像之前，在RO3306中将细胞在RO3306中停滞4小时，并在正常生长培养基中释放，并在正常生长培养基中释放。使用配备了由软沃尔克斯软件控制的CoolsNap HQ2摄像头配备了倒置的视频显微镜（Deltavision），每5分钟立即将细胞每5分钟成像16小时，以20倍的速度进行20倍。细胞舍入（有丝分裂输入）和扁平化（有丝分裂出口）用作计算有丝分裂时机的地标。此外，还测量了从冷凝到后期的有丝分裂时序。在这种情况下，通过将细胞与SIR-DNA（250 nm，螺旋色体）孵育30分钟，并进行采集，并进行了倒置Eclipse Ti-e（Nikon）显微镜，配备了配备了阶段的孵化器和CO2输送系统，配备了40×NA），配备了Intensiligh lamp hg 1300-Nikon（Nikon）nikon and nikon and nikon和Nikon hikon and nikon and nikon and nikon and nikon and nikon and nikon和（光学计量学）。所有图像均安装在Softworx中，并使用斐济软件（1.53C）进行分析。
对于有丝分裂细胞：使用RO3306（5μM）在G2中封闭细胞，并释放，然后通过诺科唑阻止有丝分裂，并随后播种以进行克隆生存。在有或没有IAA（500μm）的RO3306（5μM）中，将Polθ-MAID细胞阻塞4小时，并在有或没有IAA的Nocodazole中释放1小时。在PARPI治疗的情况下，在RO3306（5μM）中将细胞阻塞16小时，并在有或没有rucaparib（1μM）的诺科唑唑释放1小时。摇晃后，用温暖的培养基洗涤两次有丝分裂细胞，对并播种以进行克隆生存。对于相间细胞：生长的细胞用IAA（500μM）或Rucaparib（1μM）处理指示的时间，用温暖的培养基洗涤两次并计数。对于siRNA转染时的克隆性测定，每孔将150,000个细胞铺在6孔板中，并在同一天用指示的siRNA转染。第二天，将细胞洗涤两次，计数并播种以进行克隆生成。对于每种条件，将两个浓度的细胞（BRCA2 - / - 细胞：500和2000细胞；野生型细胞：50和150个细胞）的每孔播种6孔板。最终，在播种后10至14天，在室温下用蓝色甲基（Sigma，1808）染色2小时，在水中洗涤2小时，在水中洗涤，夜间干燥过夜并手动评分。
用RO3306（5μM）在G2中封闭细胞16小时，然后释放，然后通过诺科唑阻塞，然后用Rucaparib处理1小时。摇晃后，将有丝分裂细胞离心，然后重悬于预热的低音溶液（0.075 m KCl）中，并在37°C保持15分钟。然后将细胞离心，并将颗粒固定在新鲜甲醇中，并在-20°C下储存。中期扩散后，用gurr/giemsa/丙酮溶液染色（Gibco，10582013; giemsa（karyomax giemsa stain solution，gibco，gibco，10092013）），然后用gururr buffer冲洗两次。将载玻片风干，并用无水的安装介质（默克，109016）。使用Deltavision（反卷积）图像恢复显微镜以100倍的放大倍率获取图像。
在其非磷酸化和磷酸化和磷酸化的（磷酸化的丝氨酸被谷氨酸取代）中，计算了TOPBP1 BRCT7-8和POLθ肽E1472 – Y1498之间的复合物的一系列五个模型。所有模型都给出了类似的界面表示，其特征在于非磷酸化和磷酸化肽的IPTM评分分别为0.36-0.51和0.48-0.61。磷酸化突变对αFAFOLD计算的弱作用与Alphafold对单个突变的敏感性不佳一致。
数据显示为平均值±S.E.M.除了小提琴图（带有四分位数和盒子图）的小提琴图，它们显示中位数，最小值和最大值。对于所有具有统计学上的显着比较，p值均显示在图中，图中统计分析列为图例。图中指定了样本量和生物重复的数量。在这项研究中未使用盲和随机分组。除Chi-Square测试外，所有统计分析均使用Chi-Square测试计算器（https://www.socscistatistics.com/tests/chisquare2/chisquare2/defeault2.aspx）进行。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
