新兴的临床前和临床数据表明，肿瘤可以获得对突变选择性RAS抑制剂的抗性的各种潜在机制。在大多数情况下，肿瘤通过通过第二位点RAS突变的克隆的出现或通过扩增途径成员或通过补偿信号传导机制来克服RAS-MAPK信号传导的突变选择性RAS抑制。9,10,34,34,35。为了评估对多选择性RAS-GTP抑制剂的耐药性的潜在机制，我们分析了在生存研究中初步反应后复发的EP KPC胰腺肿瘤，在连续RMC-7977治疗时发展抗性。在7种可评估的EP KPC肿瘤（例如，在最终剂量后4小时收集的肿瘤，当RAS信号在幼稚的肿瘤中抑制时），6个肿瘤（86％）继续显示出对PERK表达的完全抑制（图5L），从而排除了激活Ras -Mamapk信号的几类机制。同样的六个肿瘤也表现出对PS6S235/S236和PS6S240/S244的持续抑制作用，排除了主要影响RAS信号的PI3K -MTOR组的机制（图5L）。有趣的是，由于显然重新激活的RAS途径信号传导（图5B中的肿瘤12），该肿瘤具有耐火性的一种EP肿瘤，该小鼠在治疗中存活了超过半年，比研究中的任何其他小鼠更长。
To examine a broader range of potential resistance mechanisms, we used laser capture microdissection to extract DNA from RMC-7977 treated EP tumours (all tumours available at the time of evaluation, tumours 1–11 in Fig. 5b) and performed sparse genome copy number variation (CNV) analysis, comparing both to a set of 5 vehicle-treated EP tumours as well as to historical reference samples comprising 15 KPF/+C胰腺肿瘤36（具有杂合条件无效等位基因的KPC）和16 kpcy胰腺肿瘤的细胞系37。总体而言，RMC-7977耐药的KPC肿瘤的全球基因组谱密切反映了参考样品的肿瘤（图6A）。然而，1个显而易见的例外是显而易见的：在11（64％）RMC-7977耐药性肿瘤中，有7个在MYC中表现出焦点拷贝数增长，MYC是一种致癌转录因子，从RAS途径接收有丝分裂信号（图6B）。相比之下，在36个（8％）对照KPC或KPCY样品中，只有3个在MYC基因座显示出收益（P = 0.0003，Fisher的精确测试）。额外的RMC-7977耐药性肿瘤在JUN（AP1转录因子复合物的一个规范成员）中表现出焦点增益，该复合物的作用在Ras-Mapk途径的下游以驱动增殖（扩展数据图6A） - Jun拷贝数很少在PDAC或其他CATCINOMAS中得到报道。最后，在两种情况下，两种耐药的KPC肿瘤表现出编码PI3K家族成员的基因（肿瘤8中的PIK3CA和肿瘤7中的PIK3C2B）的局灶性增长，在两种情况下，MYC中的增益共同出现（扩展数据图6A，B）。在EP KPC肿瘤子集（用媒介物治疗的三个和三个用RMC-7977处理的三个）中，对MYC基因座的靶向重新取证提供了对RMC-7977治疗的EP肿瘤中MYC拷贝数增长的存在正交验证（EPRED的EP肿瘤（ERTED DATADED数据图6B）。一起， 这些数据表明，具有三重复合抑制剂（例如RMC-7977）的宽RAS-GTP抑制作用KPC胰腺肿瘤沿着较狭窄的进化途径的耐药性途径与突变特异性RAS抑制剂相比（经常用RAS途径激活），并具有最大的信号转换。
为了进一步研究MYC拷贝数收益的相关性，我们从六个RMC-7977耐药性肿瘤中建立了细胞系，其中有四种已确认有MYC的收益（请参阅补充表3）。来自耐药性肿瘤的所有六行对RMC-7977的敏感性都比对照kPC细胞系（K8484）衍生自治疗的KPC肿瘤，并确认在MYC基因座（MYC稳定）中没有增益（图6C）。用自发的MYC增益鉴定出了另一种治疗的KPC细胞系（K2293），并发现对RMC-7977的敏感性相应较低。值得注意的是，RMC-7977耐药性肿瘤的所有线也表现出对下游MAPK途径效应效果MEK和ERK的抑制剂的抗性（扩展数据图6C）。然后，我们使用基于质谱的蛋白质组学比较了RMC-7977与DMSO治疗在一条MYC-GAIN耐药线（K18509R）中的效果（K18509R）和Naive Myc稳定线（K8484）（图6D）（图6D），并查询了在功能型基因组合中的每条差异蛋白质表达签名。尽管两条线均显示了RMC-7977处理后的实验性MAPK途径基因表达特征（方法）的下调，但在MYC-7977响应于MYC-7977的RMC-7977时，与MYC-7977相比，在MYC-7977中差异表达，而不是在MYC-GEAN耐药线中（图6D，比较沿垂直和水平轴的方差）。
在两种细胞系之间发散的基因集中，YAP-taz响应签名在敏感线中被RMC-7977降低，但在抗性线中被激活（图6D）。这使我们假设YAP – TAZ途径在支持MYC驱动的RMC-7977的抵抗力中发挥了作用。为了测试在体内响应RMC-7977治疗的YAP – TAZ途径，我们首先对SD，1WK和EP KPC小鼠的肿瘤样品进行了RT-QPCR分析。我们发现，YAP1和几种已建立的YAP靶基因（CYR61，ANKRD1，AMOTL2，BIRC5和ECT2）的表达最初是针对RMC-7977治疗的响应而下调的，尤其是在治疗1周后（扩展数据，图6d，24小时，24小时的时间点）。然而，相同基因的表达在获得对RMC-7977的耐药性的EP肿瘤中显示最小的调节甚至上调。IHC染色对同一肿瘤中BIRC5（Survivin）的蛋白质产物的IHC染色得到补充（扩展数据图6E，F），表明对RMC-7977的耐药性的获取与RAS-MAPK-MAPK独立的YAP途径的表达和活性的发展相吻合。
为了从药理学上确认RMC-7977耐药性肿瘤细胞依赖于YAP途径活性，我们检查了KPC衍生的细胞系对pan-Tead抑制剂IAG93338的反应，无论是单独还是与RMC-7977结合使用。Western印迹分析发现，YAP靶标，例如Survivin，ECT2和MYC蛋白，在两种RMC-7977幼稚线中明显抑制（尽管没有CYR61蛋白），而MYC仅部分抑制了MYC，而其他YAP靶标则在两种反抗的RMC-7977中没有改变。值得注意的是，与RMC-7977联合添加IAG933完全抑制了在抗性线中检查的MYC和所有其他YAP靶标，并在所有情况下均通过CPARP诱导凋亡。最后，使用RMC-7977与IAG933结合使用剂量降低实验发现，这些药物在来自RMC-7977耐药和天真的KPC肿瘤的PDAC细胞系中具有累加或协同作用，以及在八个人PDAC的7A（图7A）以及七个ext and pdAc Plisend（图7A）（图6F）（图6F）（图7A）（图7A）（图7A）。总之，这些结果表明了一种潜在的手段来抵消对多选择性RAS（ON）抑制的抗性。
突变 - 敏锐的RAS抑制剂作为RAS成瘾癌的治疗剂的可能性已与广泛持有的假设纠缠在一起，即针对人类靶向野生型Ras的可能性将无法忍受。确实，小鼠模型几乎没有证据来指导对规范RAS家族成员广泛抑制的影响的期望。KRAS的纯合子敲除产生早期（E3.5）胚胎致命表型20，而造血谱系中有条件的缺失最终损害了造血率21。但是，这些实验均未准确地模拟通过小分子，广谱RAS抑制剂来实现的RAS的抑制作用。也许最接近的相似之处是通过诱导的负蛋白Omomyc39的诱导表达来表达MYC的全身抑制（作为RAS信号的导管）。这种方法表明，对生理MYC活性的抑制作用降低了大多数上皮组织的增殖，但是这种关键的上皮功能在很长一段时间内得到了广泛的维持。系统性的RAS抑制可能被证明在本质上是相似的，并且与Mutants3相比，正常组织中的活性RAS-GTP水平相对较低，正常组织中相对较低的活性RAS-GTP（RMC-7977的靶标）和RMC-7977的亲和力降低。这与先前的工作一致，表明与RAS中学的肿瘤细胞不同，正常细胞可以在RAS途径抑制后迅速恢复体内平衡41。RMC-7977在KRAS突变肿瘤细胞中相对于正常组织的明显抗增殖性，促凋亡的作用与致癌基因依赖性的概念一致，并解释了我们在高度化学化的KPC小鼠模型中观察到的总体生存的显着扩展。
随着RAS（ON）多选择性抑制剂（例如RMC-6236）通过临床开发的进展，响应持续时间和抗药性机制的关键问题将成为中心。PDAC是一种非常塑料恶性肿瘤，能够适应并克服极端环境和积极的干预措施。但是，异常的RAS信号传导是建立PDAC生物学的基本支柱。批准的RAS（G12C）抑制剂的临床经验，特别是在非小细胞肺癌中，表明有丝分裂RAS信号传导的恢复是肿瘤中频繁且首选的耐药机制，如果给予机会。我们的证据表明，靶向突变体和野生型Ras蛋白使胰腺肿瘤更陡峭的耐药性途径，在很大程度上排除了通常使用突变选择性RAS途径抑制剂观察到的某些机制。RMC-6236进行的正在进行的临床研究可能揭示了这种限制的抗药性机制是否直接转化为人类更耐用的反应。如果MYC改变在治疗RAS（ON）多选择性抑制作用的患者中很常见，RAS和YAP-TAZ-TEAZ途径的联合靶向可能会为治疗使用此类改变的PDAC肿瘤提供研究范围。总之，我们的发现对RMC-6236单一疗法的RAS（ON）多选择性抑制剂的翻译具有重要和积极的意义，对PDAC和潜在的其他类型的RAS吸收的癌症患者表示了重要的。
