没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。
将HEK293T和U2OS细胞保持在DMEM+谷歌（Gibco，10566-016）和10％FBS中（VWR，89510-186）中。所有细胞系均直接从UC Berkeley细胞培养设施中购买，该设施通过短串联重复分析对经过身份验证，并使用分支机构PCR检测试剂盒（ABMGood，G238）经常测试对支原体污染。所有细胞系均对支原体测试。对于半乳糖的生长，没有葡萄糖的DMEM（Gibco，11966025）用20 mm的半乳糖补充。
使用聚乙基亚胺（PEI； Polysciences 23966-1）以1：6的DNA（以μg）与PEI（以1 mg ML – 1库存浓度为1 mg Ml – 1库存浓度）或Lipofectamine 3000转染试验，以1：6的比率进行质粒转染。使用指示的siRNA（最终浓度为20 nm）和3μL（12孔板）或6μL（6孔板）Rnaimax（Thermo Fisher，13778150）进行siRNA转染。这项研究中使用的siRNA序列可在补充表6中获得。在HEK293T细胞中通过使用Lipofectamine 3000共转染肺病毒和包装质粒在HEK293T细胞中产生。植物病毒和包装质粒3000。在转移后48 h和72 h，使用了48 h和72 h，使用了lentii-lintii-lintiii-takane（take）浓度为48 h和72 h。等分并存储在-80°C下以供以后使用。对于慢病毒转导，将105个细胞接种到24孔板中，并在添加慢病毒颗粒和6μgml-1多紧甲烯后，在1,000g下进行离心45分钟（Sigma-Aldrich，TR-1003）。HEK293T在适用时感染后24小时，将HEK293T转导的细胞被药物选择：尿霉素（1μgml– 1; Sigma-Aldrich，p8833）;Blasticidin（7.5μgml– 1; Thermo Fisher，A1113903）;或湿霉素（75μgml– 1; Gibco，10687010）。
以下慢病毒构建体被用于感染人类胚胎（ES）细胞：（1）表达GFP和SGRNA序列GGTCATCATCATCATCATCGAGAGGGGGG的慢病毒载体PLG15_UBR4_GFP（SGUBR4）在Mu6启动者下方；（2）慢病毒矢量PLG15_NC766_MORANGE（SGCNTRL）在MU6启动子下表达Morange和对照SGRNA序列GGGTGATGCGGACGCCCG。这些慢病毒是通过使用PEI与三种辅助质粒（PRSV-REV，PRRE和VESICULAN PLASMATIL PLAMIDS COTIRUS G蛋白表达载体）共转染的HEK293T细胞（美国型培养物收容，CRL-3216）。然后将慢病毒颗粒通过0.45 µM滤光片（EMD Millipore，SLFH05010）过滤，超速离心，重悬于DMEM中，比原始体积小100倍，并存储在-80°C下。将人类H1 ES细胞保持在含有新霉素（最终浓度为300 µg Ml – 1; Thermo Fisher，11811098）和潮霉素（最终浓度为50 µg Ml – 1; Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，H3274）上的300 µg ml – 1; Thermo Fisher，11811098）中的人H1 ES细胞。人类H1 ES细胞用作基因工程的父母线。用piggybac载体用UBC-DCAS9-BFP-KRAB/EF1α-RTTA-T2A-T2A-HYGROMYCIN和超级PiggyBac转座酶表达载体（System Biosciences，PB210PA-1）转染ES细胞。在选择了50 µg mL-1湿霉素1周后，通过FACS对BFP阳性ES细胞进行排序，并在连续稀释系列中进行板条。通过手动刮擦，在组织培养引擎盖中的倒置显微镜下挑选了单个克隆。选择流式细胞仪分析中100％BFP阳性的克隆，并用piggybac载体用TETO-NGN2/EF1A-RTTA-IRES-NEO和SUPER PIGGYBAC转座酶表达载体转染，并使用Lipofofectamine STEM剂转染试剂。由300 µg mL – 1的新霉素选择的细胞使用2周进行了进一步的实验。
为了产生UBR4敲除细胞，使用ACCUTASE（创新的细胞技术，AT104）短暂地分解培养物，在岩石抑制剂Y-27632的存在下，在Matrigel的6孔板中以每孔5×105个细胞的密度为5×105个细胞（Axon Medchem，1683）。同时，加入如上所述（每孔3孔板）制备的慢病毒。电镀后的第二天，将培养基更改为没有Y-27632的StemFlex培养基，第二天，新霉素和杂种霉素被重新引入培养基中。为了分析ISR激活，将用SGCNTRL或SGUBR4慢病毒感染的细胞用0 µM或5 µM砷酸钠（Fisher Scientific，7142-16）处理8 h，均在200 NM Isrib（Sigma Aldrich，Sml0843）的存在下和不存在。治疗后，使用ACCUTASE分离细胞，用PBS将3×洗涤，并通过桌面离心颗粒。细胞颗粒在液氮中捕集，并在-80°C下储存直至蛋白质印迹分析。
对于非脱神经元实验，在WTC-11背景中（来自M. Ward，NIH的礼物），携带强力霉素诱导的鼠神经蛋白-2（NGN2）的诱导多能干细胞（IPS细胞）在MTESR Plus Plus（STEMCELL PLUS，100-027-027-2276）中维持在WTC-11背景中的DCAS9 – KRAB（NIH M. WARD）。356231）。指南RNA（NTC：GTGCACCCGGCTAGGACCGG; UBR4：GGGGAGCCCGCAGTAGTACGA）被克隆到PMK1334矢量中（M. Kampmann，Addgene，127965），并被透明肠杆病毒tranduction子引入IPS细胞。如先前所述42进行神经元分化。简而言之，使用ACCUTASE（Stemcell Technologies，07920）解离IPS细胞，并在含有谷氨酸的DMEM/F12的N2诱导培养基中进行了重胶（Gibco，10565018），1×MEM NEAA（GIBCO，11140050），1×N-2 CO，1×N-2 CO，1×MEM NEAA（GIBCO），1×MEM NEAA（GIBCO），1×N-2 CO，1×N-2 CO，（2μgml– 1）和Chroman I（50 nm; Medchem Express，HY-15392）。N2诱导培养基每天更改，省略了ChromanI。在接触强力霉素的48-72小时后，通过ACCUTASE治疗将预分化的神经元分离，并在涂有多雌氨酸涂层（Sigma Aldrich，p3655，p3655）12件细胞中，以5×105个细胞的神经元培养基（包括50％的50％的培养基）（Sugma Aldrich）进行了回复（Sigma aldrich）。05790），50％DMEM/F12（Gibco，11039021），1×B-27加补品（Gibco，A3582801），GDNF，BDNF，NT-3（10 ng ml – 1 ey）Gibco，23017015）和强力霉素（2μgml– 1）。3天后，使用含有100％无强力霉素的100％脑网的神经元成熟培养基进行了完整的培养基变化。在对聚 - 雌激素涂层的板上进行了重新录入后，在第7天进行了药物处理。
在补充表4中提供了本研究中使用的所有构建体的列表。大多数克隆都是使用吉布森组装使用HIFI DNA组装主混合物（NEB，E2621L）进行的。
本出版物中使用的所有CRISPR – CAS9编辑的细胞系都是由HEK293T细胞产生的。SGRNA序列是使用IDT提供的在线资源设计的。将用于SGRNA的DNA寡核苷酸及其互补序列被磷酸化（NEB，M0201），将其退火并结扎到PX330中。将HEK293T细胞在6孔板中培养，并在50％汇合处与2 µg PX330质粒（以及使用Mirus Transit-293 Transit-293转型试剂（Mirus，mirus，mir2705），使用Mirus Transit-293 Transit-293 Transit-293 Transit-293 Transit-293 Transit-293 Transit-293 Transit-293。转染后48小时，将单个克隆扩展在96孔板中。通过PCR和DNA测序筛选纯合子克隆，并在适用时通过蛋白质印迹确认。
如先前所述，生成HEK293T FLAG -UBR4和FLAG -UBR5细胞。为了生成ΔUBR4细胞，使用两个SGRNA用原始的序列序列5'-GGTTGATGATACTATCTACC-3'和5'-CCTTACCTTACCTAGGCTAACCAAG-3'去除外显子2。在FLAG-UBR4背景中生成ΔKCMF1细胞，使用两个SGRNA用原始的序列序列5'-TGTAATCTCAGCTGCTCCGGG-3'和5'-ACGGTATATATACATCATCACTGAGC-3'去除外显子3。为了生成KCMF1 – Flag，我们使用了以下sgrna：5'-gaattgggatgtcatcaaag-3'和ssodn5'-GCTTTAGAAAACCTAAATTTAAAAAGAGAGAGAGAAGGAAAGGAAATGAGCCTCCCCCCCCCTCTCTCTCTTGGCGCGCGCCAGCCAGACTACAAAGACACCATGACGGGGTGATTATAAagatCatgatatCgatCaGatgAcgAcgAcaAgtgAcaAgtgacatCaTccaatcCaAttcgCagacaAtgtcctctgtgtgtgctgtgcccaatgccaatgaaatgaaagtggacaa-3'。
UBR4-ΔKCMF1 (Δ2333–2498), UBR4-ΔUBR (Δ1653–1725), UBR4-ΔCALM (Δ4036–4131) were generated in the Flag–UBR4 background with the following protospacer sequences that created in-frame deletions: UBR4-ΔKCMF1:5'-GGGTTTCCACAATACCAGC-3'和5'-CTGTGACACACGCTCACTAT-3';UBR4-ΔUBR：5'-CAAGCCCCCTTAGCTC-3'和5'-GTTGACTCGCAAAATGACCCG-3';UBR4-ΔCALM：5'-GAGCGTGTTAAGAGAGCAG-3'和5'-GAGTGACCTTAAGCTCAATG-3'。
如前所述43产生ΔUBR5细胞。为了生成ΔRNF126细胞，使用以下SGRNA去除外显子2：5'-GCCCTCCCCCCAGGACCCCACGGGTT-3'和5'-GCTCTTCCAGCCTCTCTTCAAC-3'。
使用以下SGRNA生成DELE1 – HA细胞：5'-Gaaaggagtgtgtgtgtaagact-3'和5'-agtcttactcaacactcctttc-3'和ssodn5'-ctattcccccaccccccccccccccccccatgaaaggagtgtgtgtgtagtaagactaggtttttttttttgcccccgtatgatgatgttcggtcggtcggtcgtgctggctgctacccccatacgacgacgtcccagactacgctgctcccccataCgtcccagccagcttaaggtaaggtgagataaaaaaaaAcatagtcctggtgcctgcctttaggggccaggcaggcgggcaggcaggaggaggagggg-3'。
如前所述，我们遵循CRISPR -CAS9筛选协议44。简而言之，通过使用Mirus Transit-293转染试剂将人壁虎V2文库（Addgene，1000000048）与HEK293T细胞一起转染（Addgene，1000000048）通过转染HEK293T细胞获得了合并的SGRNA病毒。Hek293T WT和ΔUBR4细胞在12孔板中用8μgml– 1聚甲烯的多种感染，在0.3的多种感染中旋转。将细胞用胰蛋白酶胰蛋白酶作用，并在第二天在15厘米板上进行回复，并用嘌呤霉素（1μgml– 1）选择3天，直到未转导的对照细胞全部死亡。选择呼毒素后，将细胞分裂并在每15厘米板的密度为2.5×106个细胞的密度下，并标记为0。细胞在DMEM+谷氨酸中生长，用青霉素 - 链霉素（Gibco，15070063）在DMEM+Glutamax中生长，并每3天分裂至第21天，屏幕的最后一天。培养细胞，以使每个SGRNA元素至少在整个屏幕上保持500个细胞的表示。根据制造商的规程，在第0天和第21天收集了70×106细胞的基因组DNA提取（Zymo Research，d3100）进行的基因组DNA提取。用Q5高保真DNA聚合酶（NEB，M0491）扩增SGRNA编码区域。汇总给定样品的所有PCR，并使用500 µL执行具有0.65×和0.9×截止值的Ampure珠清洁（Beckman Coulter，A63881）。样品在8％TBE凝胶（Thermo Fisher，EC6215Box）上运行，凝胶纯化并在UC Berkeley Vincent J. Coates J. Coates基因组学测序实验室上进行了HISEQ4000。使用count_spacers.py44处理SGRNA计数。随后，与WT细胞相比，Castle45被运行以鉴定ΔUBR4细胞中合成致死或保护性的顶级候选基因。我们使用了非表达的基因（如HEK293T WT细胞中的零转录本（TPM）所定义，通过RNA-Seq分析，n = 4,710） 作为负面对照基因集，而不是非靶向控制指南（SGNTC）运行城堡。这允许更具代表性的背景分布，因为Lentiv2库中很少有SGNTC，并且由于缺乏切割46，它们会引入偏见。为了鉴定富含候选基因的途径，我们以负面的城堡效应为5％的顶级城堡评分，并延伸基因本体学富集分析（Cytoscape，Chuego v.3.7.1）。补充表1中有城堡效应和分数。
质谱法对从40个15 cm板的免疫沉淀物进行，内源性标记标记的UBR4或KCMF1 HEK293T细胞系（补充表2）。将细胞裂解在裂解缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.5，150 mm NaCl，0.2％NonIDET P-40，苯并酶（Sigma-Aldrich，E1014），1倍完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，Roche，11836170001），11836170001），1×PMSF，1×PMSF，1毫米NAF和1MMMMMMMMMMMMMMMMMM MM S.通过在21,000g处离心阐明提取物，并与抗FLAG M2亲和树脂（Sigma-Aldrich，A2220）结合2小时，在4°C下进行2小时。然后将免疫沉淀物洗涤4×，并在30°C下用0.5 mg ml – 1的3×FLAG肽（Sigma，F4799）在1×PBS加0.1％Triton X-100中洗脱3×。汇集了治疗，并用20％三氯乙酸在4°C下沉淀过夜。Spun down pellets were washed 3× with an ice-cold acetone and 0.1 N HCl solution, dried, resolubilized in 8 M urea buffered in 100 mM Tris pH 8.5, reduced with TCEP, at a final concentration of 5 mM, (Sigma-Aldrich, C4706) for 20 min, alkylated with iodoacetamide, at a final concentration of 10 mM (Thermo Fisher,A39271）持续15分钟，用100 mM Tris pH 8.5稀释4倍，并用补充CaCl2（最终浓度为1 mm）的0.5 mg ml – 1的胰蛋白酶（Promega，v5111）消化，在37°C下过夜。将胰蛋白酶消化的样品提交给UC Berkeley的Vincent J. Coates蛋白质组学/质谱实验室进行分析。使用多维蛋白识别技术（MUDPIT）处理肽，并在LTQ XL线性离子陷阱质谱仪上进行运行。为了识别高信心相互作用的人，对我们实验室中执行的无关FLAG免疫沉淀物的质谱法进行了comppass Analysis47。对于图1E，将蛋白质光谱计数标准化至总光谱计数，乘以106，添加了1，并获取log2（log2（（（光谱countssprotein/总光谱计数））×106+1）。在FLAG -UBR4样本中（FLAG -UBR4平均为2个生物学重复）或3个频谱计数，在FLAG -UBR4样本中具有2个以上光谱计数和comppass z得分的蛋白质> 80％> 80％，在散射图上绘制了FLAG -KCMF1样本中最大Z分数的comppass z分数> 80％的分数。对于扩展数据图2D，我们以类似的方式将值归一化，但使用了诱饵的光谱计数而不是总光谱计数。在扩展数据中绘制了确定的交互器的一个子集图2D。补充表2中有使用COMPPASS计算的总光谱计数和Z分数。
使用慢病毒PLVX-GFP-P2A-blasticidin或plvx-mcherry-p2a-blasticidin载体转导HEK293T和ΔUBR4细胞以表达GFP或MCHERRY。对于SGRNA耗竭竞争测定，将5×104 WT – GFP和5×104ΔUBR4-MCHERRY细胞混合在24孔板中，并用慢病毒颗粒自旋感染，如上所述。24小时后，将病毒上清液除去，并将细胞膨胀至6孔板，并用嘌呤霉素选择5天。选择后进行了12天的竞争测定。当指示时，在选择抗生素后，在整个竞争测定中添加了Isrib。使用BD LSRFortessa仪器确定MCHERRY+细胞和GFP+细胞的百分比，并使用FlowJo 10.8.1分析，并标准化为SGCNTRL比率。据报道，对于每个测试的每个SGRNA，麦克利标记与GFP标记的细胞的比率为（ΔUBR4SGRNA/WTSGRNA）/（ΔUBR4SGCNTRL/WTSGCNTRL）。
对于药物竞争测定，将5×104 WT – GFP和5×104ΔUBR4-MCHERRY细胞混合在6孔板中。第二天，添加了72小时的药物。使用BD LSRFortessa仪器确定MCHERRY+/GFP+细胞的比率，并使用FlowJo 10.8.1分析，并将其标准化为未处理的样品。据报道，麦克利标签和GFP标记的细胞的比率为（ΔUbr4Treatment/wtTreatment）/（ΔUbr4Control/wtControl）。对于DMEM+半乳糖的生长，进行了11天的竞争测定，并将MCHERRY/GFP比标准化与DMEM+葡萄糖的生长比标准化。流式细胞仪分析的门控策略如图2所示。
对于使用药物处理的细胞进行的为期3天的生长竞争实验，我们使用了以下药物浓度：2.5μm砷酸钠（Ricca Chemical，714216）；2.5μm寡霉素A（Santa Cruz Biotechnology，SC-201551）;50 nm烤面包酮（Sigma-Aldrich，R8875-1G）;10μMCCCP（Cayman Chemicals，25458）;5μMBTDCPU（EMD Millipore，324892）;10 nm thapsigargin（Sigma-Aldrich，T9033-.5mg）;100 nm绝经霉素（Calbiochem，65438010）;1.25μmEN6（Sigma-Aldrich，SML2689-5MG）48;4 nm Bafilycin A1（Selleck Chemicals，S1413）；和40 nm 17-DMAG（Selleck Chemicals，S1142）。对于过夜的药物治疗，我们使用了5μM砷酸钠，10μMCCCP，0.2μMLigomycin，5μM抗霉素A（Santa Cruz Biotechnology，SC-202467）或以其他方式在图中指示。为了抑制蛋白酶体或自噬，我们分别使用了2μMCarfilzomib（Selleck Chemicals，S2853）6 h或700 nm Bafilycin A1 A1，持续6小时。Isrib（Sigma-Aldrich，SML0843）以200 nm的浓度使用。
基于先前描述的成像实验20进行了线粒体分裂GFP进口流动流仪的基于基于GFP重建的测定，测量GFP11标记的蛋白在线粒体基质中进行重构的测定。将HEK293T和ΔUBR4细胞用MTS-MSCARLETT-GFP1-10-IRES-PURO转染，并在96孔板中以每个细胞的密度为单元，并选择使用普霉素选择的随机整合的单个克隆。选择了由流式细胞仪确定的MSCARLETT表达相同表达的单细胞克隆，并用于进一步实验。将细胞用0.5μg的诱导GFP11报告基因构建体（TRAP1-GFP11-IRES-BFP，HMT2-GFP11-IRES-BFP或CS-GFP11-IRES-BFP）和1.5μg的空载体构造使用Lipofectamine 3000。使用BD LSRFTRESTESA仪器再孵育24小时后，进行流式细胞仪。线粒体导入的计算是Mscarlett+细胞中GFP+/BFP+比率的函数。流式细胞仪分析的门控策略如图2所示。
如前所述21，生成了PCS2+-Degron-GFP-IRES-MCHERRY报告构建体。如前所述23。补充表4列出了所有PCS2-Degron-GFP-IRES-MCHERRY构建体。GFP标记的候选靶标库（与图2B相关）包括SIFI的遗传和物理相互作用的蛋白质以及蛋白质与蛋白质的蛋白质相互作用，与蛋白质亚基在蛋白质Analymics Analyses49或跨越遗传学的属性（decterymics）（Sifi）（SIFI）（SIFI）（SIFI）（dec.将细胞以200,000个细胞密度为6孔板中。第二天，使用PEI将40 ng的记者质粒和最高400 ng的载体转染到6孔板上的HEK293T细胞中，并在48小时后收集用于流式细胞仪。当进行siRNA耗竭时，将200,000个细胞接种在6孔板中。第二天，如上所述，使用Lipofectamine rnaimax进行了siRNA转染。第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000转染了50 ng的记者和最高500 ng总DNA的空矢量。报告转染24小时后，收集细胞并处理流式细胞仪。使用BD Bioscience LSR Fortessa或LSR Fortessa X20分析细胞，并使用FlowJo分析GFP/MCHERRY比率。流式细胞仪分析的门控策略如图2所示。
为了对全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，通过在PBS中洗涤，颗粒和快速冻结在指示的时间点收集细胞。将细胞裂解在补充有Roche完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，11836145001）的裂解缓冲液（150毫米NaCl，50 mM HEPES pH 7.5和1％NP-40替代品）中，Phosstop磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche，4906833737001），Carfilib（Carfililz），Carfilib（phosstope）蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma，11836145001）（EMD Millipore，70746-4）在冰上。然后使用Pierce 660 nm蛋白质试剂将样品归一化为蛋白质浓度（Thermo Fisher，22660）。接下来，将2×尿素样品缓冲液（120 mM Tris pH 6.8，4％SDS，4 M尿素，20％甘油和溴酚蓝）添加到样品中。使用指定的抗体进行SDS -PAGE和免疫印迹。使用Proteinsimple Fluorchem M设备捕获图像。
在PBS中洗涤后收集细胞，颗粒并冻结。将冷冻的沉淀重悬于裂解缓冲液中（40毫米HEPES pH 7.5，100 mm NaCl，0.1％NP40，Roche完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich，11873580001），Phosstop磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche Cocktail（Roche）（Roche，497373737001），490683737373737001，phosstop phosstopSelleckChem，S2853）和苯甲酶（EMD Millipore，70746-4）在冰上孵育20分钟，并在21,000g，4°C下离心20分钟。浆液（Sigma-Aldrich，A2220）在4°C下旋转1-2小时，并使用指示抗体捕获了2×尿素样品缓冲液的2倍尿素样品缓冲。
在收集2μg的PCS2-HRI-3×FLAG和10μgPCS2-HIS-泛素 / 15 cm板的情况下，将五个15 cm板的WT HEK293T或ΔUBR4细胞收集前2天转染。用Carfilzomib（2μM）处理细胞6小时，收集并冷冻。将细胞裂解在1 ml的8 m尿素裂解缓冲液中（8 m尿素，300 mM NaCl，0.5％NP-40，50 mm Na2HPO4，50 mm Tris-HCl pH 8，10 mm咪唑，10 mm n-乙基甲基甲基酰胺（10 mm N-乙基甲基）（Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，sigma-aldrich，e3876），rochtor cokit cocktien cocktite cokit cocktien cocktiation cocktien cokit cocktiation cokit cocktiation cokit cokit cocktiation cokit cocktiate11873580001），phostop磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche，4906837001），Carfilzomib（2μM，SelleckChem，S2853），在室温下孵育20分钟。将样品在20安培中超声检查10 s（1 s ON/1 s关）。将样品在室温下以15,000克离心15分钟，并将上清液标准化为体积和蛋白质浓度。接下来，将5％的样品删除作为输入，并将样品添加到平衡的Ni-NTA树脂中，并在室温下旋转4小时。用洗涤缓冲液（8 m尿素，300 mM NaCl，50 mM Na2HPO4和50 mM Tris-HCl pH 8）洗涤树脂两次，其中含有20 mM咪唑，一次是含有40 mm咪唑的洗涤缓冲液，并用含有200 mm咪唑的Laemmli样品洗脱。使用指定的抗体进行SDS -PAGE和免疫印迹。使用Proteinsimple Fluorchem M设备捕获图像。
以下抗体用于免疫印迹分析：抗flag（小鼠，克隆M2，Sigma-Aldrich，F1804；稀释1：1,000）；抗flag（兔子，细胞信号技术（CST），2368;稀释1：1,000）;抗HA-TAG（Rabbit，C29F4，CST，3724;稀释1：1,000）;抗GAPDH（兔子，D16H11，CST，5174；稀释1：1,000）;抗α-微管蛋白（小鼠，DM1A，Calbiochem，CP06；稀释1：1,000）;抗UBR4/p600（兔子，A302，伯特基，A302-277A；稀释1：1,000）;抗UBR4/p600（兔子，A302，伯特基，A302-278A；稀释1：1,000）;抗UBR4/p600（兔子，A302，伯特基，A302-279A；稀释1：1,000）;抗PKR（Mouse，B-10，Santa Cruz，SC-6282；稀释1：200）;抗GCN2（Mouse，F-7，Santa Cruz，SC-374609；稀释1：200）;抗腐烂（Mouse，B-5，Santa Cruz，SC-377400；稀释1：200）;anti-ube2a/b（鼠标，G-9，Santa Cruz，SC-365507；稀释1：150）;抗ATF4（兔子，D4B8，CST，11815s;稀释1：1,000）;抗EIF2AK1（Rabbit，ProteIntech，20499-1-AP；稀释1：1,000），抗SSBP1（兔子，proteintech，12212-1-AP；稀释1：1,000）;抗TIM8A（Rabbit，ProteIntech，11179-1-AP；稀释1：500）;抗KCMF1（Rabbit，Sigma，HPA030383，稀释1：1,000）;抗NIPSNAP3A（Rabbit，Thermo Fisher，PA5-20657；稀释1：1,000）;抗GADD34（Rabbit，ProteIntech 10449-1-AP，稀释1：1,000）;抗CREP（兔子，蛋白技术14634-1-AP；稀释1：1,000）;抗泛素（Rabbit，CST，43124;稀释1：1,000）;山羊抗兔IgG（H+L）HRP（载体实验室，PI-1000；稀释1：5,000）;绵羊抗小鼠IgG（H+L）HRP（Sigma，A5906；稀释1：5,000）;和山羊抗小鼠IgG轻链特异性的HRP共轭（Jackson Immunoresearch，115-035-174；稀释1：5,000）。以下抗体用于免疫荧光：抗TOM20抗体（Rabbit，ProteIntech 11802-1-AP;稀释1：500）和二级抗体山羊抗兔AF647（Thermo Fisher，A21245； A21245;稀释1：500）。
如前所述50，将体外合成的底物都克隆到包含SP6启动子的PCS2矢量中，并在补充表4中总结了SUMO标签。将SUMO TAG附加到HRI和DELE1以溶解性。通过在10 µL小麦胚芽提取物（Promega，L3260）中孵育2.5 µg质粒DNA来产生35S标记的底物，并在25°C处补充了2 µM Carfilzomib和1 µL Carfilzomib和1 µL 35S-MET（Perkinelmer，Neg009H001mc）的35s-met（Perkinelmer，Neg009H001mc）。35S标记的底物用于体外泛素化测定。
对于体外泛素化测定，使用内源性FLAG -UBR4 HEK293T细胞系纯化了人类SIFI复合物。每个体外泛素化反应都需要来自2.5 cm板的FLAG-UBR4细胞的材料。将冷冻的细胞沉淀在每10 15 cm板（40 mm HEPES，pH 7.5，5 mm KCl，150 mm NaCl，0.1％NonIDET P-40，150毫米）中裂解30分钟，在1 ml裂解缓冲液中裂解30分钟板）。将裂解的提取物在21,000g处固定以去除细胞碎屑，并与抗flag M2树脂（每2.5 cm板的材料的20μl浆液）结合2小时，在4°C下旋转2 h。用清洁剂（40 mm HEPES，pH 7.5，5 mm kcl，150 mm NaCl，0.1％NonIDET P-40，1 mM DTT）和2×没有洗涤剂（40 mm HEPES，40毫米HEPES，pH 7.5，5.5 mm kcl，150 mm nacl和1毫米1毫米）洗涤UBR4偶联的珠2倍（40 mm HEPES，pH 7.5，5 mm kcl，150 mm NaCl，0.1％NonIDET P-40，1 mM DTT）和2倍在添加体外泛素化反应之前，使用压碎的凝胶加载尖端从珠子中除去所有液体。
In vitro ubiquitylation assays were performed in a 10 μl reaction volume: 0.5 μl of 10 μM E1 (250 nM final), 0.5 μl of 50 μM UBE2A (2.5 μM final), 0.5 μl of 50 μM UBE2D3 (2.5 μM final), 1 μl of 10 mg ml–1 ubiquitin (1 mg ml−1 final)(R&D Systems, U-100H), 0.5 μl of 200 mM DTT, 1.5 μl of energy mix (150 mM creatine phosphate (Sigma-Aldrich, 10621714001-5G), 20 mM ATP, 20 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH to 7.5 with KOH), 1 μl of 10× ubiquitylation assay buffer（250 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl和100 mM MGCL2），预先混合0.5μl1mg Ml – 1串联泛素结合实体（管），并添加到10μL的UBR4耦合床树脂中。接下来，将3μl体外翻译的底物或1μltamra标记的肽添加到反应中。添加竞争者蛋白质或肽，或1×PBS以达到10μL的最终体积。在补充表7中总结了本研究中使用的肽序列。在30°C的摇动中进行2小时进行了反应。通过在放射自显影前添加2×尿素样品缓冲液并在SDS -PAGE凝胶上解析，从而停止了反应。Tamra标记的肽泛素化测定测定在4–20％的梯度凝胶（Thermo Fisher，EC6026Box）上进行，并使用蛋白质Imimple Fluorchem M Imager成像。To test ubiquitin linkage specificity of SIFI, we used commercially available recombinant human ubiquitin mutants (R&D Systems, UM-K6R, UM-K11R, UM-K27R, UM-K29R, UM-K33R, UM-K48R, UM-K480, UM-K63R, UM-NOK, UM-K60, UM-K110, UM-K270,UM-K290，UM-K330和UM-K630）。E1酶UBA1如前所述51纯化。如下所述，纯化了UBE2A，UBE2D3，TUBE，TOM20 WT和TOM20（I74，V109S）重组蛋白。
将人UBE2A和UBE2D3克隆到PET28A HIS标记的表达载体（PET28A-6×His-ube2a，PET28A-6×His-ube2d3）中，并在lobstr-blb21（de3）-ril细胞中表达。来自PET28A-6×HIS-TEV-HALO-4×ubiquilinuba在lobstr-Bl21（DE3）-RIL细胞中表达。用250μmIPTG在18°C下用250μMIPTG在OD600 = 0.6处诱导蛋白质表达。将细胞在裂解缓冲液中裂解（50 mM HEPES pH 7.5，500 mM NaCl，10 mM咪唑，10％甘油，5 mM BME，1×PMSF（Sigma-Aldrich，p7626），1 mg MG MG ML-ML – ML – 1 lysozyme（Sigma-Aldrich-Aldrich，l6868686866866876-10g）。通过离心在90分钟的孵育中与平衡的Ni-NTA琼脂糖珠孵育（Qiagen，20350）之前，通过离心阐明了裂解液。将珠在洗涤缓冲液（50毫米HEPES pH 7.5、500 mm NaCl，10％甘油和5 mM BME）中洗涤3×，并增加咪唑浓度升高（20 mm，40 mm，40 mm和60 mm）。在储存缓冲液（50 mm HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，10％的甘油和2 mm DTT）中，使用透析盒（Thermo Fisher，66380）在洗涤缓冲液和250 mM咪唑中洗脱蛋白质，并透析过夜。在透析期间，将TEV蛋白酶（在1μg：100μgTeV与蛋白质比，UC Berkeley QB3 macrolab）中添加到Halo-TEV管中。第二天，管蛋白被绑定到平衡的Ni-NTA琼脂糖珠，并收集流通液以去除TEV蛋白酶和未溶解的蛋白质。使用Amicon Ultra-4 3 K（UBE2A，UBE2D3）和10 K（管）（Tubes）（Sigma-Aldrich，UFC800324，UFC801024）浓缩透析蛋白，并储存在-80°C以供未来使用。
HIS-SUMO-TEV-TOM20（62–128）和His-Sumo-TEV-TOM20（62–128，I74，V109s）被克隆到PET28A His标记的表达向量（Pet28A-6×His-Sumo-Tommo-Tomm20，Pet28A-6×His-Sumo-sumo-Tomm-sumo-sumo-tompy）中，分别为V109S，V109S）lobstr-bl21（DE3） - ril细胞。在对数期为250μMIPTG的对数期在18°C下诱导蛋白质表达。使用LM10微荧光液，将细胞在裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl，10 mM咪唑，5 mM BME和1 mM PMSF）中裂解。在用平衡的Ni-NTA琼脂糖珠孵育1小时之前，将裂解液澄清，并在洗涤缓冲液中洗涤珠（50 mm HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，5 mm Bme和20 mm咪唑），并在含有250 mmmmmmmmmmmmmmmmmm的蛋白质中洗脱蛋白质，并在含蛋白质中洗脱。缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl和5 mM BME），其中含有TEV蛋白酶（在1μg：100μgTeVtev与蛋白质比，UC Berkeley QB3 macrolab）。第二天，透析蛋白被绑定到平衡的Ni-NTA琼脂糖珠，并收集流通液以去除TEV蛋白酶和未切换的蛋白质。流通液在S75柱（50 mm HEPES pH 7.5、150 mm NaCl和1 mM TCEP）上运行。含有蛋白质的馏分在coomassie上进行验证，浓度为Amicon Ultra-4 3 K，等分，闪光并储存在-80°C以供将来使用。
WT SGCNTRL，ΔUBR4SGCNTRL，WT SGTIMM8A，ΔUBR4SGTIMM8A，ISRIB处理（200 nm，16 H）ΔUBR4SGTIMM8A和ARSENITE的WT sgtimm8a和arsenite且arsenite prested（5 µm，16 H）WT sgcnn sgcnl sgcnlr sgcntrr sgcntrrr sgcntrrrrrrrrrr swhastrrrrrrr swhastrrrrrrrr s sgcnrrrrrrrrr s inPBS，沉淀和快速冻结。每种情况都处理了三个生物学重复。使用Nucleospin RNA试剂盒提取总RNA（Macherey-Nagel，740955）。图书馆的准备和深度测序是通过Novogene进行的。简而言之，使用Polyt寡核苷酸附着的磁珠从总RNA纯化mRNA。mRNA被碎裂，并用随机六聚体进行第一链合成，然后进行第二链cDNA合成。接下来是终端维修，A量表，适配器连接，尺寸选择，放大和纯化。通过在Illumina Novaseq Sequencer上的配对末端测序对库进行测序。
为了获得转录本丰度计数，使用Kallisto（V.0.48.0）映射了测序读数为人类参考转录组（GRCH38，ENSEMBL版本96）。通过从给定基因的所有转录本中求和计数或TPM来获得基因级计数估计值。使用DESEQ2（参考52）在Galaxy服务器（Galaxy v.2.11.40.7）上进行差异基因表达分析53使用WT SGCNTRL作为所有样品的控制。补充表3中提供了DESEQ2分析结果。保留了> 1 tpm的基因以进行后续分析。选择了用砷酸钠处理的WT SGCNTRL细胞中显着差异表达的基因（P调节<0.05），至少显示了两倍变化。在Custer（v.3.0）54中进行层次聚类，并使用Java TreeView55可视化结果。HEK293T WT SGCNTRL和WT SGHRI接受了参考文献的寡霉素治疗。23（NCBI基因表达综合（GEO）标识符：GSE134986）也被聚集并用于隔离上调的ISR基因簇。原始数据和处理的数据已在登录号GSE232191下存放到GEO。
使用Nucleospin RNA试剂盒纯化总RNA（Macherey-Nagel，740955）。使用恢复第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）生成cDNA，并使用2×KAPA SYBR SYBR SYBR快速QPCR Master（Roche，KK4602）在LightCycler 480 II仪器（Roche）上进行RT -QPCR。使用ΔΔCT方法计算表达的倍数变化。QPCR引物序列在补充表5中列出。
将U2OS细胞在12毫米的12毫米玻璃盖玻片（Fisher Scientific，1254580）上以每孔100,000的细胞接种。第二天，使用Lipofectamine 3000使用PCS2-HRIHELIX2-GFP-IRES-MCHERRY转染细胞。转染后24小时更换培养基。转染后48小时，将细胞固定在4％多聚甲醛的溶液中，在1×DPBS中固定20分钟，然后在1×DPBS中用0.3％Triton X-100通透性，持续20分钟，最后在1×DPBs中用10％FBS封闭30分钟。用抗TOM20抗体（1：500）在1×DPB，10％FBS和0.1％Triton X-100中探测样品。将样品与继发抗体山羊抗兔AF647（1：500，Thermo Fisher，A21245）一起孵育，并用Hoechst 33342（1：3,000，Anaspec，83218）染色1小时。所有样品处理均在室温下进行。用延长的金（Thermo Fisher，p36930）将盖玻片安装在显微镜载玻片上，并使用带有Airyscan 2显微镜的Zeiss LSM 900成像。用×63的油物镜和Airyscan SR捕获图像。使用Zen Blue（Zeiss）Airyscan加工和斐济处理图像。
The following freely or commercially available software and codes were used to analyse data: FlowJo (v.10.8.1), GraphPad Prism (v.9), ImageJ2 (v.2.9.0/1.53t), Cytoscape ClueGO (v.3.7.1), CasTLE (v.1.0), Kallisto (v.0.48.0), DESeq2 (Galaxyv.2.11.40.7），群集3.0和java treeview（v.1.1.6r4）。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
