如前所述25。对于所有小鼠白血病实验，将男性和雌性SLC6A6+/+和SLC6A6 - / - 小鼠用作供体，B6-CD45.1（B6.SJL-PTPRCAPEPCB/BOYJ）或C57BL6/J小鼠用作移植者。对于人类细胞的异种移植实验，将NSG小鼠（NOD.CG-PRKDCSCID IL2RGTM1WJL/SZJ）用作移植受者。所有小鼠均为6-16周龄。随机选择用于体内研究的所有动物接受对照或治疗。根据基因型，年龄和性别选择动物。没有使用统计方法来实验预先确定样本量。根据先前的出版物1,3,6确定了足够的样本量。小鼠在罗切斯特大学的动物护理设施中繁殖并维持。所有动物实验均根据罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在通风笼中具有相同的性别，在12 h – 12 h的光线周期下，温度（64-79°F）和湿度（冬季水平， <30%; summer levels, >70％）控制。给小鼠富集材料，并喂养标准的食物饮食。将受照射的受体维持在酸水水支持（pH 2.5-3.0）和辐照的磺胺饮食（Mod Labdiet 5p00中，具有0.025％的Trimeth和0.124％的硫磺）。NSG接收者安置在BSL-2设施中。使用CRISPR – CAS9基因编辑与奥古斯塔大学的转基因和基因组编辑核心设施合作生成CDO1FL/FL小鼠。将这些小鼠饲养到MSC特异性的PRRX1-CRE（B6.CG-TG（PRRX1-CRE）1CJT/J）中生成CDO1FL/FLPRRX1-CRE+小鼠，其中牛磺酸在MSC/Osteolineage细胞中被阻断。由于可以在雌性种系中表达PRRX1-CRE，因此仅将雄性Prrx1-Cre+小鼠用于繁殖和实验。由于研究人员需要了解每个实验的条件，因此盲目与小鼠实验无关。因此，没有必要进行流式细胞仪，FACS，Western印迹，海马分析，测序和成像使用分析机和盲目性。
将细胞悬浮在汉克斯的平衡盐溶液（Gibco）中，其5％FB和2 mM EDTA。如前所述，准备细胞进行FACS分析和分类1,6。用于定义造血细胞种群的抗体如下：CD3ε，CD4，CD8，GR1，CD11B，TER119，CD45R和CD19（全部用于谱系），套件，SCA1，CD48和CD150。所有抗体均购自Ebioscience，Biolegend或BD Biosciences。补充表2中提供了抗体的详细列表。在LSRFortessa（BD Biosciences）上进行了分析，并在FACSARIA II（BD Biosciences）上进行了细胞分选。使用FlowJo分析数据。
逆转录病毒MSCV-BCR-ABL-ABL-IRES-GFP（或-TNGFR）和MSCV-NUP98-HOXA9-IRES-YFP（或-HUCD2和-TNGFR）用于生成BCCML。使用MSCV-MLL-AF9-IRES-TNGFR和MSCV-NRA（G12V）-IRES-HUCD2或MSCV-AML-ETO9A以及MSCV-NRAS（G12V）-IRES-YFP生成AML。Raga（Q66L； Addgene，99712）和Rheb（Q64L； Addgene，64607）被克隆到MSCV-MCHERRY骨架中（Addgene，52114）。根据制造商的协议，设计并将慢病毒shRNA构建体设计并克隆到PLV-HU6-EF1A绿色或PLV-HU6-EF1A-RED主链（Biosettia）中。补充表1中提供了SHRNA序列的详细列表。在293T细胞（ATCC）中，使用X-tremeg-Hp Reegent（Remeg-Hp Reegent（Receenne）（lentivirus生产），在293T细胞（ATCC）以及VSV-G，GAG-POL（逆转录病毒生产）或PRSV-REV，PHCMV和PMDLG/PRRE（Lentivirus生产）中产生了病毒。收集病毒上清液3至6天，然后在20,000 rpm的超速离心浓度2 h。
Bone marrow KLS cells were sorted from Slc6a6+/+ or Slc6a6−/− mice and cultured overnight in X-VIVO15 (Lonza) medium supplemented with 10% FBS (GeminiBio), 50 μM 2-mercatpoethanol, SCF (100 ng ml−1, R&D Systems), TPO (10 ng ml−1, R&D Systems) and青霉素 - 链霉素（Gibco）。用MSCV-BCR-ABL-IRES-GFP（或-TNGFR）和MSCV-NUP98-HOXA9-IRES-YFP（或-HUCD2或-TNGFR）逆转录病毒感染。通过将SLC6A6+/+或SLC6A6 - / - 小鼠中的骨髓KLS细胞排序并在补充了20％FBS，50μM2-er 2-甲醇的RPMI培养基（GIBCO）中进行培养来产生AML，从而产生AML。系统）。感染后48小时收集用MSCV-MLL-AF9-IRES-TNGFR和MSCV-NRA（G12V）-IRES-YFP细胞倒流感染细胞，由BCR-ABL+和NUP98-HOXA9+（仅BCCML）和近传中的Co57 7 hoxa-hoxa9+（仅BCR-abl+和NUP98-hoxa9+）分类（6）老鼠。对于AML-EtoA9和NRA，将细胞移植到致命的辐照（9.5 Gy）C57BL/6J受体中，以及3×105 RBC裂解的骨髓救援细胞。对于次级移植，将来自原发性BCCML受体小鼠的LIN-细胞移植到二次受辐照的受体中。将接受者维持在酸性水氢采集和辐照的磺胺饮食上，并每天进行评估。接受其他牛磺酸（T8691，Sigma-Aldrich）的接收者在没有牛磺酸的常规食物上维持（D10012GI，研究饮食）。将牛磺酸溶解在高压粉的酸水中，并在无菌水瓶中供应。对于体内Venetoclax治疗，每天在含有10％乙醇的溶剂中，将Venetoclax（ABT-199; Tocris Bioscience）溶液新鲜，并以60％Phosal 50 pg和30％PEG-400和30％的PEG-400进行，并由口服烤架以最终剂量的最终剂量为50 mg / kg。GES（多伦多研究化学品或Medchemexpress）和TAG-HCL（由搪瓷合成） 将溶解在高压粉的酸水中，并从无菌水瓶（GES）或腹膜内（i.p.）（tag-hcl）提供。对于体内雷帕霉素治疗，雷帕霉素（卖出化学物质）储备溶液（50 mg ml-1）在乙醇（Sigma-Aldrich）中进行。每天在含有8％乙醇和10％TWEEN-80溶液的10％PEG-40的车辆中，每天将股票的一次性等分试样新鲜稀释。老鼠接受了腹腔移植后第5-10天，每公斤雷帕霉素或车辆5毫克。在指定的实验时间点或终点，在预灭虫的动物安乐死。对于所有实验，每天都要密切监测小鼠的疾病或发病症状，并在可见的驼背背部，未能成长或任何感染迹象后对安乐死。对于任何实验，这些限制均未超过。通过流式细胞仪，RNA-SEQ，蛋白质组学，代谢组学或固定的组织学来收集相关组织并分析相关组织。使用膜联蛋白V和7AAD（EBIOSCIENCES）进行凋亡测定。在单个I.P.之后，使用APC BRDU流动盒（BD Biosciences）对体内溴脱氧尿苷（BRDU）掺入进行分析。注入BRDU（10 mg ml -1时2 mg）。
根据制造商的协议，使用RNeasy微型或迷你套件（Qiagen）提取RNA。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度。用Agilent Bioanalyser 2100（Agilent Technologies）评估RNA质量。使用BBIO-RAD CFX Manager 1.1 V.4.1（Bio-Rad）或Thermo Fisher Scientio Quancio Scientio pont Studio 12K Flex flex实时PCR，使用Quantio V.1.1.1.2（Thermo v.1.2（Thermo）V.1.1.2（Thermo v.1.2（Thermo v.1.2），使用Breda COFX96 C100 Thermocycler，使用逆转录（RT – QPCR）进行定量PCR。使用Bio-Rad CFX Manager 1.1 V.4.1或Quant Studio V.1.2分析RT – QPCR数据。
如前所述，分离了微环境种群。61。简而言之，在1×介质199（Gibco）中，从长骨和骨盆中分离出骨髓和骨髓，具有2％FBS（Geminibio）。将来自3-5只小鼠的骨髓细胞在含有2 mg ML-1分散酶II（Gibco），1 mg ML-1胶原酶IV（Sigma-Aldrich）和20 ng ML-1 DNase II型II（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）的HBS中消化30分钟。将骨香料在补充的PBS中消化60分钟，并补充了2.5 mg ML -1胶原酶I型（干细胞技术）和20％FBS。使用RBC裂解缓冲液（Ebioscience）对消化的骨髓进行红细胞散热。合并骨和骨髓细胞，并在汽车细胞分离剂（Miltenyi Biotec）上磁耗尽CD45+ TER119+造血细胞。通过流式细胞仪（BD LSRFortessa）对CD45-TER119-基质细胞进行染色，并分析候选人群，或通过分选（BD FACSARIA II）进一步富集并为SCRNA-SEQ进行处理。
根据制造商的建议，使用Chromium Next Gem单细胞3'GEM，库和凝胶珠子KIT v3.1（10x基因组学）处理细胞悬液以生成SCRNA-Seq库。将样品加载到铬单细胞仪器（10倍基因组学）上，以在乳液中产生单细胞凝胶珠（GEMS）。进行GEM逆转录（GEM-RT），以从聚腺苷酸化的mRNA中产生条形码的全长cDNA。孵育后，破碎了宝石，回收了合并的宝石-RT反应混合物，并用硅烷磁珠（Dynabeads Myone Silane珠，Thermo Fisher Scientific）纯化cDNA。通过PCR进一步扩增纯化的cDNA，以生成足够的材料进行图书馆的结构。酶促碎片和尺寸选择用于优化cDNA扩增子大小，并通过终端修复，A尾巴，适配器连接和PCR构建索引测序文库。最终文库包含Illumina桥扩增中使用的P5和P7启动位点。在Illumina Novaseq 6000 S2流循环中对小鼠样品进行了测序，而在Illumina Novaseq X-Plus 25B Flowcell的几个车道上对人类样品进行了测序。使用默认参数使用CellRanger v.4.0.0 MKFASTQ和计数对样品进行反复列出并计数。将样品与包含10倍提供MM10-2020-A小鼠参考的自定义参考和额外的EGFP序列对齐。
Seurat v.4.1.0在R v.4.1.1中用于大多数处理。此外，Dplyr V.1.2.0和Tidyverse V.1.3.2广泛用于数据管道和转换。将样品导入，并以每个细胞捕获的至少200个特征过滤细胞，并过滤特征在至少3个细胞中表达。应用了其他过滤器，从而滤除了所有线粒体含量高于5％的细胞，并滤除所有对CD45，CD71，TER119和EGFP呈阳性的细胞。使用“合并”合并了所有样品，并使用sctransform进行了标准化，从而消退了线粒体特征的影响。使用前40个主要成分（RUNPCA）进行主成分分析，并使用Findneighbor和Findcluster生成簇（分辨率= 0.5）。还使用前30个主组件使用RunuMAP进行UMAP尺寸还原。最初使用SCMCA V.0.2.0键入簇。从数据集中过滤为非粒细胞（B细胞，前B细胞，前B细胞，亲养细胞，亲养蛋白细胞，中性粒细胞和巨核细胞）的种群。使用已发表的骨髓基质标记进一步键入种群13。在特定种群的背景下使用了Findallmarkers来确定哪些基因随着时间的推移会发生显着变化。DeGReport实施（V.1.30.3）degpatterns用于将谱系特异性表达模式与时间点联系起来。使用RERHICHR-3.0，对应于kegg_2019，go_biological_process_2021，wikipathways_2019_mouse和CHEA_2022数据库的kegg_2019，go_biological_process_2021，go_biological_process_2021，go_biological_process_2021，使用renrichr-3.0的表达模式传递给基因集富集。
根据赫尔辛基宣布并获得罗切斯特大学机构审查委员会（IRB）的批准，从具有MDS/AML的患者获得了MDS/AML患者的骨髓抽吸物。为了隔离骨骼，骨髓抽吸物通过40μM细胞滤网。用PBS洗涤含有香料的过滤器，并将其放在六孔板中。在37°C的胶原酶（干细胞技术）中，将尖晶剂在胶原酶（干细胞技术）中消化1小时。过滤后，通过密度离心（Ficoll-Paque，GE Healthcare），使用过滤的抽吸物来隔离骨髓单核细胞。将消化的骨细胞和骨髓单核细胞汇总，并用CD45-APC（BD Biosciences）染色，然后用抗APC Microbeads（Miltenyi Biotec）染色。使用LD柱（Miltenyi Biotec）将染色的细胞用于CD45-细胞馏分的磁耗尽。如上所述，将CD45-细胞用于SCRNA-SEQ。
使用Seurat v.4.1.0在R V.4.1.1中将包含表达COL1A1的细胞的样品集成到单个数据集中。占检测到的转录本大于25％的线粒体特征的细胞被去除。将样品缩放并合并在一起，从而退出线粒体和球蛋白相关的含量。使用HBB，HBA2，HBA1，HBD和HBM确定球蛋白相关的含量。使用Harmony V.0.1.0进行进一步的回归，以减少样品特异性效应的影响。从那里，使用了标准的seurat程序，群集至分辨率为0.8。
使用GEO GSE253355（参考文献23）创建了正常的骨髓参考。该提交的数据已归一化，使用前50个主组件运行PCA，并且使用Seurat v.5.0.3.9911中的前50个主要组件运行UMAP。然后在Azimuth V.0.5.0中使用此数据集来使用Azimuth Standard方法创建参考。然后，使用此参考将样品与runazimuth函数针对L1，L2和粗注释进行键入。
根据制造商的建议，用Qiagen rneasy和套件纯化总RNA，并在无核酸酶的水中洗脱。使用Nanodrop 1000分光光度计（Nanodrop）确定总RNA浓度，并使用Agilent Bioanalyser（Agilent Technologies）评估RNA质量。根据制造商的协议，使用了Truseq滞留的mRNA样品制备试剂盒（Illumina）进行下一代测序库构造。简而言之，用寡-DT磁珠从200 ng总RNA纯化mRNA并碎裂。使用随机六聚体启动进行第一链cDNA合成，然后使用DUTP掺入链标记进行第二链cDNA合成。然后在双链cDNA上进行末端修复和3'腺苷酸化。将Illumina适配器连接到cDNA的两端，用凝胶电泳纯化，并用适配器序列的PCR引物进行扩增，以生成大约200-500 bp的cDNA扩增子。放大的文库与Illumina单端流动池杂交并使用CBOT（Illumina）进行扩增。使用Illumina的HISEQ2500V4为每个样品生成了100个核苷酸的单端读数。
使用BCL2FASTQ v.2.19.0从Illumina baseCalls产生的原始读取。使用FastP V.0.20.1进行质量过滤和适配器去除。然后使用Star_2.7.6a映射处理后的读取映射到人参考基因组（HG38 + Gencode V36; https://www.gencodegenes.org/human/release_36.html）。使用subread farmiturecounts v.2.0.1对基因的读取映射进行计数。使用DESEQ2 V.1.28.1进行差异表达分析，在R v.4.0.2中的PADJ阈值为0.05。使用富集-3.0程序包进行了基因本体分析。
为了确定显着表达的受体，首先对上述人RNA-seq的差异表达结果进行过滤，以显着变化（PADJ <0.05）基因，其对数转换的折叠变化值的变化值大于0。使用该基因表面列表中的潜在细胞表面受体列表，在细胞表面蛋白质中与细胞表面蛋白质的详细范围内的LSC ATS19和LSC中的Ensess一起生成。进一步审查了未在细胞表面表达的基因，从而进一步审查了CHST11，ST3GAL4，ACAA1，CLCN6，CLCN6，CHPF2，CTSK，ATP6AP1，CTSD，CTSD，PNPLA6，PNPLA6，DMXL2，TUBB6，TUBB6，MAN2B2，POGER CLLN3，CLN3，MGAT4B，MGAT4B，MMMGAT4B，MYHN4B，MYHN4B，MYHNB，MYHNB，MYHNB，MYHNB，MYHNB，MYHN4B，MYHNB，MYHNB，MYHNB，myhymyhyhymyhyhymyhyhymyhymyhymyhymyhymyhymyhymyhyh4b来自与BCCML和AML表达的受体相对应的时间scrna-seq数据集的配体表达通过在整个种群中的差分表达来确定。使用Nichenetr（V.1.1.0）62和文献支持的相互作用的组合对差异表达的基因进行过滤以进行相应的配体。其中包括牛磺酸合成66，GADL1和CNDP1的NRP163，ADSL64,65，CDO1和CSAD，用于β-丙氨酸合成67,68，KIT69，CD15570和CD3371，用于在此映射中未捕获。在AML的背景下，广泛的研究所托管的数据集20被用作健康免疫微环境的立场。计数（rna_soupx1.mtx.gz）和元数据（metadata_clustering_w_header_upd.csv）从宽的单小区门户中下载（https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/scp1987/an-in-inflammatoration-state-remodels-the-microen-microenvironment-and-microenvironment-and-inmproves----------------------- 并使用seurat进口。Findmarkers用于确定与其他人群相关的微环境中哪些基因上调。然后使用与基质微环境相同的方法过滤明显表达的基因进行配体过滤。使用Circlize V.0.4.15可视化了基质微环境，免疫微环境以及BCCML和AML人体体积RNA-SEQ数据中的显着表达的配体和受体映射。出于说明目的，用数字转换的倍数变化为5或更高的配体限制为5。
Rneasy Plus微型试剂盒（Qiagen）用于RNA提取。使用Nanodrop 1000分光光度计（Nanodrop）确定RNA浓度，并使用Agilent Bioanalyser 2100（Agilent Technologies）评估RNA质量。根据制造商的建议，使用更智能的超低输入试剂盒（Clontech）预先扩大了总RNA的总RNA。随后的cDNA的数量和质量使用量子荧光计（Life Technologies）和Agilent Bioanalyser 2100（Agilent）确定。然后，根据制造商的协议，使用Nexteraxt库制备套件（Illumina）使用150 pg的cDNA来生成兼容Illumina兼容的测序库。将放大的库与Illumina流动池杂交，并使用Illumina NextSeq 550（Illumina）进行测序。为每个样品生成100个核苷酸的单端读数。处理鼠标块状RNA-Seq样品，另有两个例外与人类块状RNA-Seq相同，具有两个例外：M38 + Gencode M27参考（https://www.gencodegenes.org/mouse/mouse/release/Release_M27.html），用于在对齐和计数中使用，并在sem-s necrec中使用。有关差异表达分析的详细信息，请参见“主要人类CD34+细胞RNA-Seq分析”部分。
对于人RNA-seq实验和其他研究，从罗切斯特大学机构审查董事会批准的方案中获得的AML和BCCML患者的健康供体的骨髓样本和样品中分离出CD34+细胞，并根据赫尔辛基宣布的书面知情同意。购买了所有功能测定中使用的正常人CD34+ HSPC（干细胞技术）。在ISCOVE修改的Dulbecco的培养基中培养细胞，其中有10％FBS，100 IU ML-1青霉素 - 链霉素（Gibco）和55μm2-羟基乙醇，1×LDL（Sigma-Aldrich）和100 ng ML-1 SCF和TPO（R）（SIGMA-ALDRICH）和补充-Glutamine（SIGMA-ALDRICH）。人类白血病细胞系K562，THP1和M-V-411（ATCC）在RPMI/IMDM中保持为10％FBS，100 IU ML-1 PENICILLIN-StICILLIN-StREPSTOPTOMICIN（GIBCO）。这些细胞系已通过供应商验证。MDS-L细胞（来自K. tohyama）通过流式细胞仪为CD45+CD34+CD38+在房屋中验证，并在RPMI中维持，并添加了10％FBS，并补充了20 ng ml-1 IL-3（peprotech）。未测试细胞系的支原体。对于用SHRNA的菌落形成测定，用指定的慢病毒SHRNA转导白血病和正常细胞。感染后24小时对细胞进行排序，并将其铺在CFU测定中或将其移植在均受辐照的NSG小鼠中。
从白血病小鼠中分离出MSC，并在未补充15％FBS和100 IU ML -1 Penicillin -streptheptycin（Gibco）的MEMα中培养10 cm的菜肴中。然后，在培养开始后6天，对CD45 -CD3 -B220 -TER119 -GR1 -CD31 -CD51 -CD51+ SCA1+ MSC进行分类。分类的细胞在上面描述的培养基中膨胀。对于共培养实验，将50,000个MSC铺在48孔板中，并用指定的慢病毒SHRNA转导。然后，在感染后3天，通过切换到补充15％FBS的MEMα（Gibco），100 IU ML-1青霉素 - 链霉素（Gibco）和50μgml-1的cas orbic酸（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich），100 mMβ-甘油磷酸盐（SIGCEROL磷酸盐）（SIGMAM-β-aLMDrichAsmma-phasmma-alicmma-aLichAlchAse），诱导成骨分化。（Sigma-Aldrich）持续6天。在分化后的第6天，在补充有10％FBS，50μM2-甲醇和青霉素链霉素的X-Vivo中加入100,000个LIN-BCCML细胞。然后，在共培养后3天，分析白血病细胞的细胞生存力，并将其镀在甲基纤维素中以进行菌落形成测定。使用Cellens进入V.2.3（Olympus）在Olympus CKX41系统上获得显微镜图像。
对于骨髓移植，从SLC6A6+/+或SLC6A6 - / - 小鼠的骨髓中分离出500 HSC，并将其移植到致死的（9.5 Gy）CD45.1小鼠中，以及2×105 SCA1 sca1 depledepledepledepledepled sca1 depledepledepledepledepled sca1 depledepleded bone Bone Bone Bone Marrow Rescue crouce细胞。对于随后的继发移植，将从原发性受体小鼠分离的2×106红细胞散色的骨髓细胞移植到致命的辐照（9.5 Gy）CD45.1小鼠中。在4个月结束时，每4周收集每4周的4周，在4周内收集受体小鼠的外周血。
对于用小鼠细胞进行菌落测定，将指示的LIN- BCCML细胞或试剂盒+ AML细胞铺在甲基纤维素培养基（M3234，Stemcell Technologies）中。殖民地在7天内得分。对于使用人类细胞系或患者来源的AML样品的菌落测定，将细胞铺在甲基纤维素培养基中（H4434； Stemcell Technologies）。电镀后10-14天计数菌落数。牛磺酸拮抗剂或TAG（由烯胺合成； 92％纯），GES（G827500，多伦多研究化学品），牛磺酸（T8691，Sigma-Aldrich），MTOR激活剂（MHY1485，Sigma-Aldrich）和Venetoclax（MHY1485，Sigma-Aldrich）和Venetoclax（ABT-199，TOCRIS ISCIERIENT）。使用Chou-Talalay方法72计算了Venetoclax和GES协同定量。
Seahorse XF糖酵解应力试剂试剂盒（Agilent Technologies，103020-100）和Seahorse XF Cell Mito胁迫测试试剂盒（Agilent Technologies，103015-100）分别用于测量糖酵解通量（ECAR）和氧气消耗（OCR）。在X-Vivo中对小鼠Lin-BCCML细胞进行分类并培养48小时，并补充了10％FBS，SCF和TPO。然后，在分析前1小时，将50,000–100,000个细胞接种在细胞-TAK涂层（Corning，324240）96孔XF96 XF96海马XF培养基（Agilent Technologies，102353-100）中，并在37°C下孵育板。使用XF96分析仪（Agilent Technologies）顺序添加葡萄糖（10 mM），寡霉素（1μM）和2-脱氧葡萄糖（50 mM）后测量ECAR数据。使用XF96分析仪，顺序添加寡霉素（1.5μM），羰基氰化物-4（FCCP）（FCCP）（0.5μM），五氟甲基氢氮酮（FCCP），烤烤酮酮和抗霉素（0.5μm）后，测量OCR数据。使用波V.2.6.3（安捷伦技术）分析数据。
在补充1倍蛋白酶，1倍磷酸酶抑制剂（细胞信号技术）和250 IU苯甲酶核酸酶（Millipore Sigma）的1×RIPA（热渔民科学）中制备的细胞裂解物在梯度多丙烯酰胺上分离，并转移到硝化纤维素纤维素凝胶上，并转移到硝基纤维素纤维素含量上（0.45μ）。使用了针对磷酸化的MTOR，MTOR，磷酸化的S6K，S6K，PEIF4B，EIF4B和β-肌动蛋白（细胞信号技术）或微管蛋白（ABCAM）的一抗。马拉德族过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔抗体（细胞信号技术）用于检测一抗原发性抗体。使用SuperSignal West Femto最大敏感性底物（Thermo Fisher Scientific）开发免疫印迹。使用Empiria Studio v.2.3（Li-Cor）使用Li-Cor Odyssey M系统对免疫印迹进行了成像。使用Empiria Studio v.3.2.0.186（Li-Cor）分析图像。原始凝胶图像在补充图1中提供。
将细胞在50μL的5％SDS，100 mM碳酸氢盐三甲基铵（TEAB，Thero Fisher Scientific）中裂解，每个样品中的50μg蛋白质用Dithiothreitol（Sigma-Aldrich）还原。烷基化蛋白质并将其捕获到S-trap micros（Protifi）中，用胰蛋白酶消化，并通过在乙腈中的0.1％三氟乙酸（TFA）的顺序添加提取。然后，每个样品的1％用于全局DIA分析，然后将其余样品冷冻并在TMT标记之前将其干燥在速度Vac（LabConco）中。根据制造商的协议，将样品在TEAB中重构，并用TMT 10-Plex试剂（Thermo Fisher Scientific）标记。将所有样品合并并在速度VAC中干燥，然后使用附着在3毫升注射器（Waters）上的130 mg C18吸附剂SEP-PAK用0.1％TFA在乙腈中脱盐。根据制造商的协议，使用高选择的Fenta富集试剂盒（Thermo Fisher Scientific）将脱盐样品冷冻并干燥，然后将其干燥。将富集的磷酸化样品冷冻，干燥并使用C18自旋柱分离。通过逐步添加10 mM AmmoH，乙腈浓度升高：3.5、6.5、9.5、12.5、15.5、15.5、18.5、27、50％通过逐步添加10 mM弹药来洗脱馏分。通过组合1/5、2/6、3/7、4/8的馏分，将八个分数连接到四个。将分馏样品冷冻，干燥并在0.1％TFA中重构以进行MS分析。
将非TMT标记的肽注入了75μm×2 cm的Trap柱上，然后再用100μm×15 cm C18柱进行重新聚焦，并使用击败的NEO UHPLC（Thermo Fisher Scientific）系统连接到Orbitrap Astral质量质谱仪（Thermo fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）系统，并使用1.8μm珠（Sepax）进行重新聚焦。使用在2 kV下运行的纳米喷弹性源将离子引入质谱仪。溶剂A（水中的0.1％甲酸）和溶剂B（80％乙腈中的0.1％甲酸）形成梯度，始于1％B，并升至99％B，总运行时间为14 m。每次运行完成后，在下一次注射之前，用1％B重新校准了色谱柱。Orbitrap星体以数据无关的采集（DIA）模式进行全球蛋白质组学分析，MS1扫描以240,000的分辨率获得，最大注射时间在390–980 m/z范围内为5 ms。使用2个DA窗口，最大注射时间，HCD碰撞能量为25％和归一化的自动增益控制（AGC）500％进行DIA MS2扫描。在150-2,000 m/z的扫描范围内收集片段离子。在相同的征服NEO UHPLC和Orbitrap星体质谱仪系统上进行了磷蛋白分析，但对LC和仪器设置进行了几次更改。为了考虑TMT固有的比率压缩，样品进行高度分数以降低MS分析之前的复杂性。在48分钟内，较长的5–30％B梯度用于进一步分离磷酸肽。使用FAIMS Pro Duo（Thermo Fisher Scientific）的数据依赖性采集方法，并带有三个补偿电压（-40 V，-60 V，-80 V），以进一步降低样品复杂性。对于每个CV，在Orbitrap中进行了400–1,500 m/z的全面扫描，而在Astral Analyzer中分析了MS2扫描1 s，1 s， 之后，仪器切换到下一个简历，然后重复该过程的总周期时间为3 s。基于强度为0.5 DA隔离窗口，将电荷态在2到6之间的肽分离，并用HCD碰撞能量为35％。最大注射时间为20 ms，归一化AGC目标为100％。动态排除设置为15 s。
使用DIA-NN V.1.8.1（https://github.com/vdemichev/diann）使用library-free分析模式处理全局DIA原始数据。使用Mus Musculus Uniprot数据库（UP000005640_9606）对图书馆进行注释。对于前体离子产生，将丢失的切割的最大裂解数设置为1，可变修饰的最大数量为1（m），肽长度范围为7-30，前体电荷范围为2-3，前体M/z范围为380-980，以及片段M/z范围为150-2,000-150-2,000。该定量设置为“可靠的LC（高精度）模式”，基于RT依赖的中位数跨运行归一化，启用MBR，蛋白质推断设置为“基因”和“启发式蛋白质推断”。在库前体Q值（1％），库蛋白组Q值（1％）和后误差概率（50％）上过滤前体。Protein quantification was carried out using the MaxLFQ algorithm (https://github.com/vdemichev/diann-rpackage) and the number of peptides quantified in each protein group was determined using the DiannReportGenerator Package (https://github.com/URMC-MSRL/DiannReportGenerator).使用Perseus73进行了进一步的过滤，缺失的价值插补和统计测试。使用Proteome Discoverer Software Platform v.3.1（Thermo Fisher Scientific）中的Chimerys搜索了磷光蛋白质组原始数据，最多可允许两次丢失的裂解，碎片质量公差为10 ppm。在半胱氨酸上的氨基甲基甲基和赖氨酸和肽N末端上的TMT作为固定修饰，而蛋氨酸的氧化以及丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的磷酸化的氧化为可变修饰。使用记者离子量词节点对记者离子进行量化，集成耐受性为20 ppm，并将集成方法设置为“最自信的质心”。
在二甲苯中将石蜡包裹的4μm人体骨髓活检切片脱蜡，并使用键表质检索溶液（pH 9）检索抗原表位10分钟。内源性过氧化物酶在3％H2O2-甲醇溶液中用10分钟的孵育淬灭。然后将切片在10％的驴血清中阻塞60分钟。将切片与抗CDO1（ProteIntech）过夜一起孵育，或在室温下与抗蛋白质（ABCAM）一起孵育2小时。将切片在PBS中洗涤，并用HRP偶联的驴抗兔二抗（Jackson Immunoresearch）在室温下染色1.5小时。三次洗涤后，根据制造商的协议，使用IMMPACT DAB底物试剂盒（Vector Laboratories，SK-4105）开发颜色。然后用血久毒素对切片进行染色。每个部分的三个不同区域在Olympus BX41显微镜上成像，具有×20（0.5 Na）物镜。使用斐济V.1.54G中的IHC插件工具箱分析图像。
在存在或不存在牛磺酸（Sigma-Aldrich）的情况下，将白血病细胞培养在RPMI中，并根据制造商的协议，在牛磺酸（Sigma-Aldrich）的存在下培养白血病。MSC在35毫米玻璃底菜中生长并分化，其中包括14毫米MICROWELL（Mattek Life Sciences）。用4％PFA固定细胞，并在阻塞缓冲液中阻塞（PBS，具有5％驴血清，1％BSA和0.1％Triton X-100），并在阻断缓冲液中稀释的原代抗体中孵育过夜。使用的主要抗体包括MTOR（细胞信号技术），LAMP1（DHSB）或CDO1（ProteIntech）。在含有0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich）的PB中洗涤细胞，并用Alexa-Fluor偶联的二抗（Thermo Fisher Scientific）染色，并安装在Fluormount G（Thermo Fisher Scientific）中。
使用配备了NIS-Elements 6D成像采集模块的Nikon Eclipse Ti2倒置显微镜（v.5.42.06）的Teledyne Photometrics Prime BSI Express SCMOS摄像机，获取免疫荧光图像。尼康D-LEDI荧光LED照明系统（配备了385 nm，488 nm，568 nm和621 nm激发波长）作为主要照明源。Specific illumination wavelengths were selected by combining a large field of view quad-filter cube (DAPI/FITC/TRITC/CY5; 96378) with specific Lumencor emission filters (FF01-474/27-32, FF01-515/30-32, FF01-595/31-32, FF02-641/75-32).使用Nikon CFI60 Plan Plan Apochromat Lambda D×20（0.8 Na）物镜晶状体成像MSC和骨素培养物，并使用Nikon CFI60 Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan Plan plagromat Lambda D×100（1.45 Na）物镜。使用Imaris v.10.2（牛津仪器）对图像进行反价文，并使用斐济V.1.54G中的Jacop Biop插件进行了Pearson的共定位分析。
谱系耗尽的SLC6A6+/+和SLC6A6 - / - 小鼠白血病细胞使用BD Cytofix/cytoperm固定/透气化试剂盒（BD Bioscience）根据制造商的方案进行固定。用抗磷酸化MTOR（细胞信号技术）的一抗染色细胞。然后将细胞用与Alexa Fluro 488（Invitrogen）结合的驴抗兔二级抗体染色，以检测P-MTOR。在LSRFortessa（BD Biosciences）系统上进行了分析。使用FlowJo软件分析数据。
用5％FBS和2 mM EDTA中的汉克斯平衡盐溶液（Gibco）中的股骨分离骨髓细胞或骨髓外周液。为了分析SLC6A6遗传丧失或用牛磺酸抑制剂治疗对白血病细胞进行治疗后骨髓细胞的分析，将细胞用苯并酶核酸酶（Sigma-Aldrich）在RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中裂解。为了进行骨髓间质流体分析，将一个股骨压在1 mL缓冲液中，过滤并以1,500克离心5分钟。使用10,000个MWCO自旋柱（Corning）浓缩上清液。然后，使用牛磺酸测定试剂盒（Sigma-Aldrich/abcam）根据制造商在BioTek Synergy 2 Plate 2读取器上使用Gen5 V.3.11（Biotek）对制造商的方案来定量25μl浓缩样品。在无条件的新鲜培养基或缓冲液中校正样品的牛磺酸含量。或者，如下所述，在下面的液相色谱 - 质谱法（LC -MS）部分中所述处理细胞颗粒，并通过LC -MS（Orbitrap Exploris 240）测量牛磺酸水平。
对于未靶向的代谢组学，迅速解剖了带有SLC6A6+/+或SLC6A6 - / - 白血病的小鼠的脾脏，并在4°C下用5％FBS和2 mM EDTA在Hanks平衡盐溶液（Gibco）中解散。通过分离，染色和磁排序，收集白血病细胞并保持在4°C，以最大程度地减少代谢变化。LIN+（CD3ε -CD4 -CD8 -GR1 -CD11B -TER119 -CD45R -CD19-）白血病细胞使用LD柱（Milteny Biotec）磁耗尽。用含有5 mM葡萄糖的PBS洗涤LIN-白血病干细胞级分，并以3,000g离心1分钟，捕获冻干并处理代谢组学，如下面的“ LC-MS分析”部分中所述。
将K562细胞培养在无血清RPMI-1640培养基中的六孔板中48小时。然后将这些细胞培养在无血清RPMI-1640中，并补充了200μm牛磺酸（1,2 13c2，98％；剑桥同位素实验室）或24小时内没有额外的牛磺酸。将细胞用含有5 mM葡萄糖的PBS洗涤，并以3,000g的速度离心，frozen，并处理代谢组学的代谢组学，如下“ LC-MS分析”部分中所述。
将冷冻的细胞沉淀重悬于每1 ml的80％甲醇时，通过涡旋，转移至-80°C 30分钟，然后每10分钟涡流转移至常规冰30分钟。接下来，将样品以17,000克离心10分钟，并在真空蒸发器（Thermo Fisher Scientific）中干燥90％的上清液。将样品在50％乙腈（A955，Thermo Fisher Scientific）中重构，其体积等于干燥量的10％，并转移到玻璃小瓶中进行LC -MS分析。通过高分辨率MS与Orbitrap Exploris 240（Thermo Fisher Scientific）系统进行了高分辨率MS分析代谢物提取物，并与Vanquish Flex LC系统（Thermo Fisher Scientific）结合。然后，将2 µL的样品注入到Waters Xbridge XP Beh amide柱上（150 mm长×内径2.1 mm内径，内径为2.5 µm，粒径为25°C，带有Waters Xbridge Xbridge XBRIDGE XP Vanguard beh amide（5 mm×2.1 mm×2.1 mm Inter Dighemeter Digiemeter，2.5粒子粒子尺寸）。对于正模式采集，流动A期为100％LC-MS级H2O，甲酸铵铵和0.125％的甲酸。流动相B为90％乙腈，甲酸铵甲酸铵和0.125％甲酸。对于负模式采集，流动A期为100％LC-MS级H2O，乙酸铵，0.1％氢氧化铵和0.1％Medronic Acid（Agilent）。流动期B为90％乙腈，乙酸铵，0.1％氢氧化铵和0.1％medronic酸。梯度为0分钟，100％b；2分钟，100％b;3分钟，90％b;5分钟，90％b;6分钟，85％b;7分钟，85％b;8分钟，75％b;9分钟，75％b;10分钟，55％b;12分钟，55％b;13分钟，35％b;20分钟，35％b;20.1分钟，35％b;20.6分钟，100％b;22.2分钟，100％b;全部以150μlmin -1的流速为150μl，然后是22.7分钟，100％b;27.9分钟，流速为300μlmin -1，最后28分钟，流速为150μlmin -1，总长度为28分钟，流速为100％b。H-ESI源在喷雾电压3处以正模式运行，500 V or negative mode at spray voltage 2,500 V with the following parameters: sheath gas 35 au, aux gas 7 au, sweep gas 0 au, ion transfer tube temperature 320 °C, vaporizer temperature 275 °C, mass range 70 to 1,000 m/z, full scan MS1 mass resolution of 120,000 FWHM, RF lens at 70% and standard AGC.使用化合物Discover（V.3.3，Thermo Fisher Scientific）和EL-Maven Software74分析LC – MS数据，以进行峰值区域的测定和复合鉴定。通过与外部标准标准的LC-MS方法特定保留时间值匹配，并与外部标准和MZCloud数据库（Thermo Fisher Scientific）匹配来鉴定化合物。使用成对的Mann-Whitney-Wilcoxon秩和测试计算RAW P值，并使用Benjamini – Hochberg false-disclevery率校正计算PADJ值。数据已上传到代谢组学工作室75。
使用GraphPad Prism软件v.6.0（GraphPad）进行统计分析。数据是平均±S.E.M.单向方差分析，双向方差分析，未配对的双向学生的t检验，使用本杰明蛋白– Hochberg方法校正的多个未配对的t检验，比率对t检验和对数秩检验用于确定统计显着性。使用Compusyn72制成组合指数和异肥大图。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
