编码M. jannaschii GDGT – Mas（MJ0619; Uniprot ID：HMPTM_METJA）的基因被优化用于在大肠杆菌中的表达，并从Invitrogen Geneart Geneart Gene综合中订购，并增加了5'ndei cut位点和3''xhoi cut位点。用NDEI和XHOI限制酶消化从Geneart PMA-T载体中移除了编码GDGT – MA的基因，然后将其连接到线性化的PET28A质粒T4 DNA连接酶中。由此产生的质粒称为PMJ0619。用PMJ0619转化大肠杆菌DH5α细胞，并通过宾夕法尼亚州基因组核心设施的DNA测序确认序列。
GDGT – MA的表达和纯化是从用于通过大肠杆菌中的异源表达获得可溶性RS酶的先前建立的方法进行了修改的。用PDB1282和PBAD42-BTACTEDFB质粒的大肠杆菌BL-21（DE3）菌株通过PMJ0619转化。所得构建体的单个菌落用于接种含有50μgml -1卡纳米霉素，50μgml -1 spectinomycin和100μgml -1 ampicillin的200 ml Lb培养基培养基培养物。将起动培养物在37°C下孵育过夜，并以250 rpm摇动。在非饱满的6-l erlenmeyer烧瓶中，使用4毫升的起动培养物接种4 L乙醇胺最小培养基，含有等效的抗生素浓度，并在37°C下生长（参考文献45）。在OD600 = 0.6时，将阿拉伯糖添加到培养物中，最终浓度为0.2％（w/v），以诱导PDB1282和PBAD42-BTAUDCEFB上的ISC和BTU操纵子的表达。同时，将25 µm FECL3添加到培养基中，作为FES簇生物发生的铁源。然后将培养物生长至OD600 = 1.0，并将50μMIPTG添加到生长中以诱导GDGT -MAS的表达。将温度降低至30°C，并通过以7,000克离心收集细胞，将培养物孵育5小时。收获的细胞被闪烁，并在-80°C下储存直至蛋白质纯化。出于我们不了解的原因，使用PBAD42-BTUCTEDFB质粒的使用大大提高了MJ0619的溶解度和产量。尽管生成质粒以增强含钴胺素蛋白的溶解度，但也发现它增强了某些与钴胺素46不结合的蛋白质的溶解度。
所有剩余的步骤均在coy实验室厌氧室或密封容器中进行，以确保无氧环境。将细胞糊重悬于裂解缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.5、300 mM KCL，10％甘油，10 mMβ-羟基苯二醇（BME）和4 mM咪唑）持续10分钟。将以下试剂和酶添加到产生的溶液中，并允许孵育5分钟：1 mg ml-1溶菌酶，0.1 mg ml-1 dnase，0.17 mg ml-1 pmsf，0.8μgml-1 cysteine，cysteine，0.7μgml-1 fecl3和0.2 fecl3和0.2％x-1％x-10％x-10 x-10 x-10 00。然后以35％的幅度将细胞悬浮液超声检查总计5分钟（45 s开，7分钟左右）。将裂解物以45,000克离心，并将所得的上清液加载到用大约100 mL裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。用100 mL裂解缓冲液洗涤色谱柱，以去除所有非HIS标签蛋白。用75 mL洗脱缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，300 mM KCl，10％甘油，10 mM BME和300 mM Imidazole）从色谱柱中洗脱GDGT – Mas。将洗脱器集中在30 kDa MWCO Amicon Ultra离心滤器中。GDGT – MAS通过PD-10脱盐柱将缓冲液交换为存储缓冲液（50 mm HEPES，pH 7.5，300 mm KCl，20％甘油和1 mM DTT）。通过使用S200缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，300 mm KCl，10％甘油和10 mm DTT）的HIPREP 26/60 S200色谱柱在HIPREP 26/60 S200柱上进一步纯化所得蛋白混合物。将指示单体GDGT – MA的分数合并，浓缩，然后在液氮中闪烁冻结和存储之前将缓冲液交换为存储缓冲液。所得的蛋白质称为“ As-solated GDGT – Mas”。
M. acetivorans细胞裂解物是在伊利诺伊大学Urbana-Champaign大学的William Metcalf实验室生产的。M. acetivorans C2A菌株在HS培养基中生长，三甲胺47。通过在1.0 mL 2-丙醇（IPA）中重悬于冻干的裂解物（约25 mg）的单相中，在单相中进行总古细胞脂质提取。将混合物涡旋9分钟，超声检查15分钟，然后在4°C下在15,000克下离心5分钟，以分离有机和水层。收集了有机上层。上述提取程序在水相中又进行了两次。通过氮气将合并的有机相蒸发至干燥。对于液相色谱-MS分析，将干脂质提取物重悬于100 µL IPA中：乙腈（ACN）：水（45：35：20，V：V：V：V：V）。对于GDGT - MAS细胞脂质交换和测定，通过在50°C机械搅拌2 h的溶液2 h，将干燥的脂质提取物重悬于100 µL的50 mM HEPES，pH 7.5中。
通过孵育含有20 µm TE的1.0 ml溶液，在2.5 mm时，在2.5 mm和200 µl M.乙酰硫酸脂蛋白脂质提取物或50 µm ag cormate Bufferers的30分钟°C c c c c cy c.5 mm，在2.5 mm的蛋氨酸时，在40分钟内，在40分钟内，在40分钟内，将GDGT - MAS脱落的细菌磷脂与古细胞脂质交换为古细胞脂质。孵育后，将溶液通过PD-10脱盐柱交换到存储缓冲液中，以去除多余的脂质。最后，将GDGT – MAS集中在30 kDa MWCO Amicon Ultra离心滤波器中。所得的蛋白质称为“ M。当使用合成的Ag脂质GDGT – Mas时，当使用合成的Ag Ag脂质时，使用脂质脂质脂质提取物进行脂质交换和“ Ag脂质交换的GDGT – Mas”时。
GDGT – MAS变体是通过使用PMJ0619作为模板的位置定向诱变PCR生成的，补充表1中描述的引物。放大后，用DPNI消化PCR产物以去除父母的质粒。序列验证的构建体用于用PDB1282和PBAD42-BTUCTEDFB转换大肠杆菌BL21（DE3）菌株，如上所述，用于过表达。
如先前所述，进行了GDGT -MAS底物Ag的合成。表征与先前报道的表征相匹配。
一式三份进行活性测定，除非另有说明，否则包含2.5 µM GDGT – MAS或GDGT-MAS变体，10 µM AG，300 µM SAM，1 mM TITICRATE，200 mM KCl和10 µm -methionine-Methionine-Methionine-Methyl-D3，在75 mm Hepes，pH 7.5中。在每个时间点，从反应中取出两个等分试样。为了进行脂质分析，IPA中的五倍稀释液（56.3：43.7 v/v）含有1 µM磷脂酰甘油12：0。为了分析5'-DAH，在150 mM硫酸中通过双重稀释液淬灭反应的等分试样。
为了定量5'-DAH，将在150毫米硫酸中淬灭的反应等分试样在13,100g下在4°C下离心15分钟，以去除任何沉淀物。然后将上清液注入敏捷技术1290 IN II II系UHPLC系统，该系统耦合到6470 QQQ Agilent喷气流电喷雾电离质谱仪。在32.5°C下，在敏捷的Zorbax扩展C18 RRHD柱（2.1 mm×50 mm，1.8 µm粒径）上在色谱上分离分析物，在95％溶剂A（0.1％Formic Acid Acid Acid Acient Acient Acient Acetrip）和5％的溶剂B（乙烯硝基）中平衡。在单个注射的整个过程中，应用以下梯度：从0到0.5分钟，溶剂B保持在5％；从0.5分钟到5分钟，溶剂B从5％增加到35％；从5到6.5分钟，溶剂B增加到90％。使用多反应方法以正模式检测分析物。使用Agilent MassHunter定量分析10.1软件，准备了5 µm-甲氨酸 - 甲基-D3（内标）的5'-DAH（500 nm至50 µm）的标准曲线。
为了进行脂质分析，将含有1 µM磷脂酰甘油12：0的ACN（56.3：43.7 V/V）淬灭的反应等分试样在4°C下以13,100g的速度离心15分钟，以去除任何沉淀物。然后将上清液注入与H-ESI离子源的Thermo Scientific Q Extive HF-X质谱仪相连的热科学征服UHPLC系统。在45°C下在45°C下在60％溶剂A（60:40水：ACN：ACN：ACN，具有10毫米氨基酸的ACN和40％的溶液液和40％溶液b（90％）IS ACN（90％mmon），在45°C下，在45°C的敏捷Zorbax延伸C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 µm粒径）上进行色谱分离脂质分离。和0.1％甲酸）。在单个注射过程中，应用以下梯度：从0到2分钟，溶剂B增加到75％；从2到11分钟，溶剂B增加到85％；从11到17分钟，溶剂B增加到99％。使用H-ESI毛细管温度为320°C的全扫描方法以负模式检测到分析物。从0到12分钟，全扫描MS以50.0 eV的源内CID收集，分辨率为120,00，AGC目标为3×106，扫描范围设置为M/Z 400–2,500。从12到24分钟，全扫描MS以30.0 eV的源内CID收集，分辨率为60,00，AGC目标为1×106，扫描范围设置为M/Z 1,200-2,000。分析物的响应比相对于1 µM磷脂酰甘油12：0的内标。
X射线衍射数据集收集在高级光子源，Argonne National Laboratory和Berkeley结构生物学中心（BCSB）Beamlines的一般医学科学和癌症研究所合作访问团队（GM/CA-CAT），位于Lawrence Berkeley国家实验室的高级光源。使用HKL2000或HKL3000软件包对所有数据集进行处理，并通过使用Autosol/Hyss或使用程序phaser49,50,51,52的单个异常分散量相逐一来确定结构。模型构建和改进是用Coot和Phenix.Refine进行的，分别为49,53。配体几何约束是从等级Web服务器（全局相分）获得的54。用Molprobity Server55对结构进行了验证和分析Ramachandran异常值。使用Pymol56制备图形。使用Hollow57制备主动位点腔映射。
通过在室温下通过悬挂液蒸气扩散方法，通过将1 µL的储存缓冲液中的GDGT – MAS与1 µL溶液与1 µL井溶液（0.3 m硫酸钠，15％（w/v）Peg 3350，2.5 mMMMM MMM）混合，通过悬挂液蒸气扩散法在室温下通过悬挂滴蒸气扩散法生成棕色，板状的GDGT – MAS晶体（2.5mm和2.5 MMMMMMMM，tlod），2.2550''，通过悬挂液蒸气扩散法（0.3 m thiocyanate，15％（w/v）5 mmmmmmmm和2.5 mMMMMMMM，蛋氨酸）。通过安装人造丝环上的安装，然后在冷冻保护剂溶液（Perlluoropoteryether Oil（Hampton Research））中浸泡并在液氮中闪烁冻结，准备了晶体以收集数据。
在Fe K-Edge X射线吸收峰（1.73818Å）处收集单波长异常衍射阶段的衍射数据集。在单独的晶体上收集了本机数据集。苯金斯中最初的相位尝试表明，GDGT-MAS可能包含四个不同的含铁的金属晶体活性剂49。通过将其中三个重原子位点建模为[FE4S4]簇58，从而获得了增强的相信息。随后在苯金斯中进行相分化。用13个铁地点的autosol产生了适用于模型建筑物的高质量电子密度图49。增强的总数为0.36，贝叶斯-CC为44.7（参考文献49）。phenix.autobuild用于生成506中366个残基的初始模型，其RWORW/RFRE为0.30/0.37。然后在COOT中手动调整所得模型，并在Phenix49,53中进行完善。然后，该模型被用作搜索模型，用于通过Phenix中的分子替换来逐步分析天然数据集。最终模型由-2至0的残基组成（表达式标签上的残基），1-375，382–501，三个[Fe4s4]簇，一个Fe（II）离子，一个5'-DAH，一个5'-DAH，一个MET和两个分子和两个分子的磷脂酸（LPP）。Ramachandran分析表明，有98.38％的残留物为有利的地区，允许地区剩余的1.62％。数据收集和完善统计数据在扩展数据表1中提供。
通过将1 µL的GDGT – Mas（5 mg ML-1）溶液与1 µL井溶液（0.1 M MES，pH 6.5，20％（p pH 6.5，20％w/v）peg 300 mmm mm毫米，通过将1 µL的GDGT – Mas（5 mg ML-1）溶液混合，通过在室温下的悬挂液蒸气扩散法（5 mg ML-1）混合1 µL溶液，通过悬挂的滴蒸气扩散方法生成棕色的，板状的晶体。通过安装人造丝环上的安装，然后在冷冻保护剂溶液（Perlluoropoteryether Oil（Hampton Research））中浸泡并在液氮中闪烁冻结，准备了晶体以收集数据。
该结构是通过分子置换的，使用GDGT-MAS – LPP – 5'-DAH-MET络合物的坐标作为搜索模型50。手动模型构建和精炼分别在Coot和Phenix中进行了49,53。活性位点中未建模的电子密度分配为两个古细胞脂质分子：L1P和Ag。最终模型由-1至0的残基组成（表达式标签上的残基），1-375、380–397、402–499，三个[Fe4s4]簇，一个Fe（II）离子，一个5'-DAH分子，一个MET MOLECUEL，一个MET MOTE MET MOTE MET MOTE MET SOTE MOTE。
酶功能倡议酶相似性工具（EFIES）（https://efi.igb.illinois.edu）用于对Interpro家族IPR034474的全部逐个爆炸分析进行全部爆炸分析（与当前名称'甲基transferase_class_d与5,224序列相似的当前名称），以创建5,224序列的序列，以创建一个初始序列。（参考文献59,60,61）。为了消除蛋白质片段，在创建序列相似性网络期间应用了EFI片段选项，以排除Uniprot-new的蛋白质片段。所有网络均在Cytoscape62中可视化和编辑。最终序列相似性网络（补充图5）包含2,525个序列，表示为单个节点，比对分数为112。
可以从Uniprot登录号Q58036访问M. Jannaschii的GDGT – Mas的Alphafold模型（参考文献63,64）。
通过直接输注或通过尺寸排斥色谱法，用加热的电喷雾电离（HESI）（HESI）（HESI）（HESI）（HESI）（HESI）（HESI）（HESI）（均为正模式）进行天然蛋白质MS。在这两种情况下，都在高质量范围模式下运行的热质量HF-X上收集数据。在前者中，蛋白质样品通过使用30 kDA截止过滤器的多个离心机循环将缓冲液交换为厌氧缓冲液（在厌氧高性能液相色谱水中200 mM乙酸铵）。将厌氧样品放入装有闭合窥视管的注射器中，从厌氧室中取出，并以5 µl min -1的流量连接到注射器驱动器。封闭的线打开并迅速连接到通过Tee连接到HESI源的TEE，从超出性液相色谱泵连接到管道。超出性液相色谱的管线以50 µl min-1的流速为50 mM N2-N2-pur的铵（总流量为55 µl min-1）。对于尺寸排斥色谱–MS，使用Yarra 1.8 µm尺寸 - 排斥色谱X150色谱柱，流速为20 µL min-1，乙酸铵N2-MM。
如下所述收集天然蛋白质质谱。在完整的MS模式下，使用Thermo Xcalibur版本4.2.47收集全扫描光谱。在AIF（M/z的2,500–5,500）下收集配体弹出光谱（插图），扫描范围设置为m/z 300-1,000。使用Thermo Scientific Freestyle 1.8 SP2审查了数据；用热科学生物制药发现器4.1对质谱进行卷积。补充表2中描述了每个图的特定数据收集参数。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
