所有涉及小鼠的实验均根据欧洲分子生物学实验室（EMBL）实验室动物管理和伦理委员会的批准方案和准则进行，并根据许可证编号进行。20190708_JH和意大利卫生部在授权守则号下。308/2021-pr。将近交C57BL/6J菌株用作主要小鼠模型，而CD1 IGS或C57BL/6J大坝被用作IVF的替代母亲。C57BL/6J小鼠缺乏瘦素（OB/OB小鼠）来研究父亲睾丸瘦素缺乏症的代际作用。小鼠在光/黑暗周期（从07:00到19:00）下放置，并随意获得常规饮食和水。标准Chow包含18.5％的蛋白质，5.3％的脂肪，4％纤维和其他营养添加剂，适合长期维持，育种，泌乳和妊娠期（NFM18，Mucedola）。
在5周龄时，将特定的无病原体（SPF）雄性C57BL/6J近交小鼠转移到常规的菌落设施中。将雄性小鼠分为单独的笼子（每个笼子一只小鼠），然后随机分配给两组：（1）对照组连续六周接受定期饮食和无菌过滤（0.2μm）水（缩写为Con小鼠）；（2）接受过定期饮食和无菌过滤（0.2μm）水的治疗组，并补充了FDA批准的NABX鸡尾酒（Neomycin 2.5 mg ml-1，杆状杆菌2.5 mg ml-1和pimaricin1.25μgml-1; Asbbrevied as n n Weeksive for Neccastive for Neccessive for Neccessive for Neccessive for Neversive。每5天，每5天都会更换水瓶和NABX鸡尾酒。在治疗6周结束时，两组的雄性小鼠均与未接受治疗的6周龄C57BL/6J近交雌性小鼠交配。在交配之后，雄性小鼠在没有NABX（恢复期）的情况下维持了8周的额外8周，并且它们可以随意获得常规饮食和无菌过滤（0.2μm）水。在8周的恢复期间，每个男性在两个时间点交配：NABX撤离后的4周和NABX后8周（分别表示为6WK+4REC和6WK+8REC）。在整个妊娠和泌乳期间，所有雌性小鼠均接受了定期的饮食和水。值得注意的是，每种抗生素的剂量低于先前研究中给小鼠给小鼠施用的标准剂量的标准剂量剂量，因此构成了相对较低的剂量状态，旨在扰动而不是消融肠道肠道菌群菌群30,48,49。
使用等效的实验设置和6周的时间课程，用于诱发急性肠癌的替代策略。首先，在被过滤的（0.2μm）水中的可吸收抗生素鸡尾酒（氨苄青霉素0.5 mg ml -1，万古霉素0.25 mg ml -1和两性霉素B12.5μgmml -1; abbreved作为AVAABX）。其次，通过使用5％PEG（PEG 4000，EMD Millipore）进行肠道清洁。在此，将父亲的雄性在饮用水中被给予AVAABX或5％的钉子6周，以引起急性肠道菌群营养不良，而随机分配的对照组仅接受无菌过滤（0.2μm）水。在6周结束时，来自每组与未接受治疗的6周龄C57BL/6J近交雌性小鼠交配的雄性小鼠。对于每种抗生素，将施用的剂量调整为先前研究中使用的标准抗生素剂量的一半，该剂量为50,51,52。同样，PEG浓度低于用于人类肠道清洁或治疗便秘的标准剂量和先前的小鼠研究31。
为了评估NABX诱导的营养不良对繁殖雄性的影响，根据定量描述性分析，对睾丸与体重比和标准男性生育参数进行了表征，其中包括海岸体重，睾丸体重，精子计数和繁殖力潜力：
为了产生自然交配和人工（IVF）的F1后代。使用一个编码系统来确保研究人员和畜牧人员对父亲治疗方案具有双重命运。
为了产生F1后代，将每只Con或Nabx雄性小鼠与一个6周龄的未接受治疗的女性放置。在交配期（1-4天）中，在标准优化的环境条件下饲养小鼠，并随意获得常规饮食和水。每天早晨检查女性的阴道状态，所有具有正面迹象的雌性（阴道塞）被从雄性笼子中取出，并安装在新的笼子中，而所有未显示阴道塞的女性在下午又回到了雄性笼子，并在每个早晨进行检查。为了最大程度地减少组合在一起之间的微生物转移，整个交配期间的交配时间限制在午后至清晨（15：00-09：00）。
如前所述54，这种F1后代生成的方法遵循五个关键步骤：（1）卵母细胞释放雌性的超排除；（2）从父亲男性制备新鲜精子；（3）从供体雌性中收集异源卵母细胞；（4）体外精子 - 素质受精；（5）胚胎转移到伪久的CD1或C57BL/6J替代母亲。此过程的执行如下：
为了区分对女性的潜在间接影响，与女性保持失调男性（例如微生物转移到母亲或NABX粪便的共生）中，我们使用了一个同居策略以及对照（独立的）男性交配。白天（09：00–16：00），将一名持续6周的NABX暴露或对照雄性的男性与一名6周龄的处女女性放置，概括了全部父母的共同曝光。在16:00将雄性从笼子中取出，以防止夜间交配，雌性仍留在雄性笼子中，以最大程度地检测微生物转移或共生作用。每天在16:00检查女性的阴道状态，所有具有正面迹象的女性（阴道塞）被排除在研究之外，而所有阴道塞子阴性的女性均持有雄性笼子。在4天的同居时期，将小鼠保持在标准优化的环境条件下，并随意获取食物和水。经过4天的同居后，所有插件阴性女性（暴露于NABX或CON雄性）与常规饲养的11周龄的C57BL/6J雄性小鼠（独立的幼稚雄性）交配，以确定在F1现实中是否可以检测到先前NABX雄性的间接影响。
F2后代是通过从失调（NABX）或Con F0 Sires中的F1一代中的两个兄弟姐妹进行了交叉而产生的。
对比较生长表型分析应用于评估产后发育的F1。使用盲代码系统进行设置，并在不了解父亲状况的情况下记录了F1表型。为了进行产后分析，记录了出生时的垃圾大小，并监测了仍然出生的幼犬。从产后P3到断奶年龄（P3 -P21），每3天每3天测量幼崽的体重，并且每周直到P56。在该年龄范围内，每天还记录了F1后代发病率和死亡率（P0 – P60）。为了考虑到极端垃圾大小的影响，要考虑离群值，仅在2 s.d以内的垃圾。在研究中包括平均垃圾大小（每个垃圾6±2只幼崽）（即4-8只幼崽）中，这对应于总垃圾的81％。同样，使用上述方法对IVF产生的F1后代的产后体重轨迹进行了表征和分析。请注意，F0孕妇以及F1后代在整个妊娠，哺乳和断奶后时期喂食常规饮食和消毒水。为了表型，源自Con或NABX处理的雄性的产前F1概念，在E13.5或E18.5时杀死了怀孕的大坝。小心地隔离，清洁和称重胎盘和胎儿。随后，分离出胚胎组织和胎盘进行转录组分析。进一步收集胎盘组织以进行免疫荧光或ELISA分析。
如前所述42分离睾丸和附子精子，以确保最大的纯度和质量。简而言之，从11周龄的小鼠中仔细剖析了睾丸，所有脂肪垫都去除了，然后分别称重，在液氮中捕集，并将其储存在-80°C下，直到处理转录组或ELISA分析。处理对侧睾丸进行组织学染色。对于精子收集，从小鼠中阐明了cauda附睾，并在37°C温暖的M2培养基中放置在M2培养基中。使用26G针头在Cauda的近端进行了两个小切口，并在其余的组织中戳了孔，以使精子散步并释放附子液。将含精子的培养基在37°C下孵育30分钟，然后转移到新鲜管中，并在37°C下再孵育15分钟。孵育后，通过以2,000克离心5分钟收集精子，然后进行1×PBS洗涤和第二次用体细胞裂解缓冲液洗涤（包含0.1％SDS和0.5％Triton-100x在蒸馏式H2O中稀释的0.5％Triton-100X）在冰中20分钟，这对于消除任何潜在的体细胞构成非常重要。然后通过3,000g离心5分钟收集体细胞裂解缓冲处理的精子样品，并用1×PBS洗涤两次，并储存在-80°C下。通过微观检查证实了精子细胞的纯化。
使用前面描述的两步酶消化方案分离出单个睾丸细胞，并进行了较小的修饰。简而言之，切除了NaBX和con男耶的睾丸，在PBS中洗涤两次，去除了Tunica Albugineas，每个睾丸转移到1 ml的裂解缓冲液中（1 mg ml -1的胶原酶A中的PBS稀释），然后使用P1000尖端进行五次triturure triturure p1000尖端，以破坏组织和在37°C中均匀地镇定到37°C，并在37°C中均匀地进行了penter up up up up up up up chake。将小管子沉淀，在室温下以300克离心5分钟。除去上清液，并用PBS洗涤剩余的组织，并在Tryple（1×）和DNase I中消化。将悬浮液急剧地伸入十倍，在37°C下孵育5分钟5分钟，然后重复进行三次三次和孵育，直到15分钟结束。依次对消化的单细胞悬浮液进行了依次的尺寸过滤，并通过70和40μm的滤网洗涤，并在300g下以300g离心5分钟。将沉淀的细胞重悬于1 ml的冷PBS+0.04％BSA中，汇集成猎鹰管（每组四个睾丸），并使用伯爵夫人II（平均生存能力为85-90％）进行计数。使用0.04％BSA的冷PBS在约1,100个细胞μL -1的范围内调节靶细胞浓度，并将其放在冰上直至将10倍铬芯片上加载。
如先前所述的57，在层流中收集了精液囊泡，并进行了轻微的修饰。为了防止交叉污染，每个样品收集的引擎盖中放置了一个实验动物（CON或NABX）。为了确保最大的灭菌，实验者穿着无菌礼服，手套，掩盖并用70％的乙醇擦洗手，并遵循以下程序。简而言之，将小鼠放在先前用70％乙醇和2％virkon的层流中，然后是2小时的紫外线辐射。为了无菌地收集囊泡，用宫颈脱位对小鼠进行安乐死，并用70％乙醇清洁其腹部区域，并用灭菌的镊子和剪刀切开。然后使用新的灭菌镊子和剪刀切除精液囊泡，并将其放置在2毫升的Eppendorf管中，在干冰中捕获冻结，并储存在-80°C下，直到开精的DNA提取进行精液液微生物组分析。注意，本样品收集中使用的解剖工具仅使用一次。
从大隐静脉微绒毛血液收集管（Microvette 100K3E SARSTEDT，目录No。20.1278.100）中收集血液样本，并在4°C下以5,000 rpm离心10分钟；获得血浆并在-80°C下存储直至测定。
根据参考文献中描述的方案收集胎盘组织。58。简短地，在E13.5和E18.5处收集样品，从E0.5计数，因为发现了交配塞的那一天。从怀孕的小鼠中除去了概念，并分割了包含单个概念的子宫角。使用显微镜，将子宫肌肉轻轻地从抗议度的侧面剥离（最少血管的侧面），切开蛋黄囊以暴露羊膜囊，并仔细地剖析了胎盘，并与Umbilical Cord和Yolk Sac分离，并收集整个胎盘圆盘，以收集整个胎盘或泪水。样品在液氮中进行快速冻结，并在-80°C下储存，直到将它们用于RNA-Seq或固定在4％多聚甲醛中进行组织学和免疫组织化学分析。
为了产生胚泡胚胎，使用了IVF。简而言之，在48小时后，用腹膜内注射PMSG（0.1 mL）和HCG（0.1 mL），将4周龄的C57BL/6J卵母细胞含量雌性小鼠超过。从对照或瘦素缺乏蛋白（OB/OB）的小鼠中制备了电容的精子悬浮液，并将其转移到含有卵母细胞的受精盘中准备的滴剂中心。注意对照（WT/WT）和瘦素缺陷型（OB/OB）雄性精子供体是源自杂合子十字（WT/OB）的窝窝，因此近乎衰减。用分离的精子将卵母细胞授精后，在37°C下在5％CO2下培养了精子 - 素质受精的菜肴3-4小时。孵育3-4小时后，将假定的合子用150μl的M2培养基洗涤3-4次，并在四孔Nunc板上培养4.5天，在5％CO2和5％O2 Incubor中，在37°C中，在37°C中补充了500μL的KSOM培养基，并在37°C中补充了500μl的KSOM培养基。4.5天后，将每个胚泡胚胎收集在0.2 mL PCR管条中（包含2 µL裂解缓冲液+1 µL DNTPS+1 µL的寡核-DT引物），以进行单个Embryo RNA-SESEQ分析（SMART-SESEQ）。请注意，裂解缓冲液组成：H2O+2UμL-1中的0.5％Triton-X100（VOL/VOL）在RNase抑制剂（20UμL-1; Thermo，AM2694）和Oligo-dt Primer中的Superase中的Superase：5'-AagcagcagtggtggtggtggtggtggtaTcaAcgCagaGagaGagaGagagaGagaGagagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagaGagtactact30Vn-3-3''。
将睾丸组织从6周处理的（NABX）或Con Sire雄性小鼠中收集，固定在Bouin的固定剂中，然后通过分级的乙醇和清除剂（Xylene）进行处理，然后在石蜡中嵌入。随后，将样品以5–7 µm的厚度连续切片，并用标准的降催毒素和曙红染色染色。使用LMD 7000激光显微镜显微镜（Leica）对生精小管（即精子，精子细胞，精子和精子细胞）和Leydig细胞的睾丸形态计量分析进行。进行异常的生精管的定量评估如下：对于每个样品，至少使用评估的1,000多个生精的小管（正常或异常）分析了至少十个部分，并相应地计算了异常小管的百分比。为此，使用Nanozoomer S60数字幻灯片扫描仪（Hamamatsu Photonics，C13210-01）拍摄图像。
将在E18.5收集的胎盘样品在4％的4°C中固定在4％的多聚甲醛中，然后将其嵌入石蜡中，并将其切成7μm-厚的切片。将截面样品安装在载玻片上，并在热板上在40°C下干燥。干燥切片在pH 6.0处使用柠檬酸酯缓冲液进行热诱导的抗原检索，并在4°C下与抗小鼠VE-钙粘蛋白（Thermo Fisher Scientific; Ebiososciences。目录号14-14441-81;2.5μgML-1）一起孵育过夜，并被抗flior;2.5μgMl-alel-cattific catti;no。用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific;目录D1306;5μgml-1）对核染色。在用延长玻璃安装（Thermo Fisher Scientific; CatalogNo。P36983）之前将载玻片洗涤，并在具有20个物镜的Leica Thunder Imager Live Cell上成像（数值孔径= 0.8）。QuPath V.0.2.1图像分析软件用于测量迷宫区域和整个胎盘的区域。
用分离蛋白B4染色E13.5和E18.5处的胎盘血管。简而言之，将7μM胎盘样品的矢状切片用二甲苯脱蜡，并通过降低乙醇浓度来补液。在10 mm柠檬酸pH 6.0缓冲液中，对幻灯片切片进行热诱导的抗原检索10分钟。此后，将这些切片用0.3％Triton-X100透化，在5％的驴血清中阻塞，并在4°C下与兔分离蛋白HRP（Sigma，CatalogNO。L5391）在4°C下孵育过夜，以2μgml-1的孵化。根据制造商的说明，使用ABC DAB试剂盒（Vector LaboratoriesNo。PK-6100）的试剂进行Chromagen检测
ELISA试剂盒用于确定生物样品中特定靶蛋白的浓度。将冷冻血浆和睾丸样品用于F0父亲雄性中的瘦素（LEP）的测量，而F1胎盘组织用于测量胎盘生长因子（PLGF）和可溶性FMS类样FMS样酪氨酸激酶-1（SFLT1）。小鼠瘦素ELISA KIT MOB00，小鼠PLGF-2 ELISA KIT MP200和小鼠VEGFR1/FLT-1 ELISA KIT MVR100（R＆D Systems）在制造商的指导下定量LEP，PLGF和SFLT1。如套件上所述，制备了试剂，标准曲线稀释液和样品，所有样品，标准和对照均以技术重复分析，并具有多种生物学重复。为了量化靶蛋白浓度，通过非线性回归模型曲线拟合来插值产生的数据。
为了量化血浆瘦素，将来自F0父亲血液并储存在-80°C中的血浆样品中的等分试样在冰中解冻，用校准剂稀释剂稀释20倍，并根据制造商的指示进行测定。
为了定量瘦素，将组织中的PLGF和SFLT1融化在冰上并在PBS中洗涤。接下来是用杵“ A”（大约十个笔触）和杵“ B”（约20笔）在2 ml的Dounce Tissue Grinder中，其中含有1 ml Ripa缓冲液（Sigma-Aldrich）与蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合，在冰中保持5分钟，温和的搅拌5分钟，在15,000 rpm中保持速度为20分钟。离心后，将清晰的上清液的等分试样用于ELISA测定。
为了筛选抗生素残基并测试NABX或其残基是否在远端组织或循环系统中检测到我们独立和互补的方法。
如下所述，制备了用于定量睾丸组织中抗生素的样品。将提取和干燥的样品重悬于20μl的甲醇中：水（1：1），将10μl样品直接注入Agilent 6550 Ifunnel QTOF质谱仪中。使用化学标准制备了校准曲线（双重稀释液），从而导致注射量的范围：细菌素（5.6-90.0 pmol），原霉素（7.0-112.5 pmol）和新霉素（5.3-85.0 pmol）。使用MassHunter定量分析软件（Agilent Technologies，v.10.0）进行抗生素的定量，并使用R。通过线性回归确定检测极限。
最早的试剂盒（R-Biopharm）用于测定储存在-80°C下的睾丸样品中的NABX或AVAABX残基，该样品根据制造商的指示进行了肉类的使用。该测试的原理基于嗜热细菌孢子（芽孢杆菌嗜热菌），对几种抗生素和硫酸化合物高度敏感。简而言之，从经过6周处理的（NABX或AVAABX）和未处理的（Con）父亲雄性中收集的睾丸被融化并用1×PBS洗涤，然后使用含有200μl的200μL含有1×PBS的Dounce TisseRinder均质化，并用pestle“ A”（大约十个strokes）和Pestle'（大约十个）和Pestle''在此，将灭菌水用作阴性对照，而在水中稀释的NABX鸡尾酒在最小残基检测极限的浓度下用作阳性对照（0.5μgml -1）。从均质的样品溶液中，将100μl移到了安培中的琼脂上，并在室温下静置20分钟以进行预置。预言之后，将样品溶液用水冲洗两次并用箔纸覆盖以避免蒸发，从而将样品溶液冲出。随后，将测试安培在64±0.5°C下在Eppendorf块加热器中孵育约3–3.5 h，直到阴性对照从紫色变为黄色。在此阶段，从块加热器中除去了安木木，并根据试剂盒双色指标解释结果。
在几个不同的时间点，从每个单独的F0父亲男性中收集新鲜的粪便样品：（1）在第0天NABX给药之前；（2）在建立交配之前在6周的治疗结束时；（3）在NABX退出后的恢复期间。在断奶阶段收集了大坝和F1后代的粪便样品（P21）。为了收集新鲜的粪便样品，将要收集粪便的父母或后代放入清洁的，无床的无床的高压灭菌的笼子中，用食物和水持续2-3小时，用消毒的镊子收集的粪颗粒，并立即将其存储在-80°C冰柜中，直到DNA液化液，直到DNA萃取液，以进行微生物介入。
将所有样品存储在-80°C下，直到通过16S rRNA测序加工。根据制造商的说明，使用Qiaamp PowerFecal Pro DNA试剂盒（Qiagen）从粪便标本中提取微生物DNA（从F0父母约200 mg，F1后代约100 mg）。简而言之，将使用DNA提取试剂盒处理的粪便样品添加到PowerBead Beat Tube管中，并使用Vortex-Genie 2 Mixer（Scientific Industries）（Scientific Industries）迅速在涡旋衔接子（Qiagen目录号13000-V1-24）上同质同。一旦细胞裂解并去除了潜在的抑制剂，就会在二氧化硅膜上捕获总基因组DNA，洗涤并洗脱以进行下游肠道微生物群分析。
通过使用F341 5'-CCTACGGGAGCAGCAGCAG-3'和R5'-ATTACCGGCGGCTGGCTGG-CTGCTGG-3'Primers，如前所述，使用F341 5'-CCTACGGGAGCAGCAG-3'确定了小鼠粪便中16S rRNA基因拷贝数的相对丰度通过对照样品的连续稀释液确定。
16S rRNA V4区域的靶向扩增（启动序列F5'-GTGCCAGCMGCCGCGGCGGTAA-3''和R806 5'-GGATCACHACHVGGGTCTAAT-3'（参考文献60）使用Kapa Hifi HofiStart PCR（Roche barc）进行了两次（Roche barc）放大器套件; Bioo Scientific;）从制造商的说明中进行了较小的修改。
使用DADA2（参考文献61）对RAW 16S rRNA读数进行修剪，去涂和过滤，以去除嵌合PCR伪像（参考文献61）。然后使用开放参考方法将所得的扩增子序列变体聚集在98％序列相似性下以98％的序列相似性聚类为操作分类单元（OTU）：首先将读取映射到使用MAPSEQ62的98％相似性的全长16S RRNA序列的预簇的参考集。如先前所述，使用HPC-Clust64，使用Undernal63对细菌和古细菌二级结构感知rRNA模型的读取与细菌和古细菌二级结构感知rRNA模型对齐，并以98％的平均链接聚类为98％的平均链接，如前所述65。通过断言保留至少1,000个读数的样品，至少有两个样本中的样本普遍存在，从而滤除了所得的OTU计数表。这些过滤器删除了58％的虚假OTU，但只有数据集中读取的0.09％。
Local sample diversities were calculated as OTU richness, exponential Shannon entropy and inverse Simpson index (corresponding to Hill diversities of order 0, 1 and 2 (ref. 66) as average values of 100 rarefaction iterations to 5,000 reads per sample. Between-sample community diversity was calculated as Bray–Curtis dissimilarity. Trends in community composition were quantified using ordination methods (principal coordinate analysis, distance-based redundancy分析）并使用置换多元方差分析（Permenova67，r package vegan68中实现）进行了测试。
To directly test whether microbiota cross-transfer occurred during the mating window period, we sampled faeces at two time points In this 4 day experiment, males from each group (CON and 6-week nABX) were cohoused at a 1:1 ratio in a single cage with a treatment-naive 6-week-old female C57BL/6J mouse continuously, regardless of plug positivity (single breeding pairs).在交配期间，两组均在常规饮食和无菌水的情况下保持。我们在两个时间点上对粪便进行了抽样：在第0天进行预旋转，以确定基线菌群，并在第4天进行术后（分别表示为效率和后交配），以检查女性与NABX雄性的女性暴露/同居的作用。此外，为了确定在交配时是否发生微生物群的转移，我们在交配后直接从雌性的阴道区域采样了一个交配塞。使用拭子，从工作区域收集了对照样品，并使用无菌尖锐的镊子收集插头样品。
对于Messenger RNA测序，根据制造商的说明，使用Rneasy Protect Mini Kit（Qiagen）从四种不同的组织类型中提取总RNA：Sire testis，F1胎盘，F1脑和F1（BAT）（BAT）。总RNA的数量和质量在纳米体分光光度计和安捷伦贴纸系统（Agilent）上进行了评估，以确保RNA完整性数> 8.5。对于文库制备，首先使用具有1μg输入RNA的NEBNEXT POLY（A）MRNA磁分离模块富集mRNA。遵循所有制造商的指南，使用Nebnext Ulta II定向RNA库准备套件，将纯化的mRNA准备成滞留的文库。放大的库是多路复用的，并在Illumina NextSeq 500（PE40）上进行了测序。
对于精子小RNA分析，使用mirvana microRNA隔离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）分离总RNA。该程序是根据制造商的说明进行的，并在细胞裂解步骤中进行了轻微的修改，以确保精子的完全裂解。简而言之，将纯化的精子样品在冰上解冻，然后在室温下加入米尔瓦那裂解缓冲液5分钟，随后将蛋白酶K的40 mM二硫硫代醇和12μlml -1蛋白酶K添加到样品中。然后将样品在56°C下在450 rpm的热塑料中孵育20分钟。在此步骤之后，将miRNA匀浆添加到裂解物中，并遵循建议用于总RNA分离的套件指令。根据制造商的说明，使用Illumina Truseq小RNA库制备套件从1μg该总RNA制备小的RNA库。图书馆在Illumina Hiseq 2000上进行了测序。
重悬于PBS+0.04％BSA中的睾丸单细胞以约1,100个细胞μl-1的浓度调节，以在10倍铬芯片上加载。按照套件说明（Chromium Next Gem单细胞3'v.3.1（双索引）用户指南）进行单元捕获和库的准备。简而言之，每个样品的捕获量约为6,000个细胞。互补的DNA合成后，将12-14个周期用于库放大。使用Illumina NextSeq 2000 P2 FlowCell（100CYC）测序协议选择，合并和测序的尺寸。
如参考文献中所述遵循该协议。69。简短地，mRNA转录本是从睾丸组织冷冻的靶向，其厚度为10μm，厚度安装在超砂岩上，加上粘附载玻片。将切片固定在3％甲醛中，用0.1 M HCl透明5分钟，并用PBS洗涤。通过在组织切片周围施加镶嵌杂交室（Grace Bio-LAB），使用随机六聚体，RNase抑制剂和逆转录酶（Blirt）将mRNA在37°C下在37°C下进行过夜。逆转录后，将组织切片固定40分钟，用PBS洗涤，磷酸化的挂锁探针（PLP）以最终浓度为10 nm/pLP杂交，并用TTH连接酶（Blirt）（Blirt）和RNAseh结扎。用PBS洗涤切片后，使用PHI29-核酶和外切核酸酶I（Thermo）在30°C下过夜进行滚动圆扩增。孵育后，除去试剂，在PBS中洗涤两次样品，并用镊子将安全腔室除去，然后在室温下在杂交缓冲液（2×SSC，20％formamide）的室温下杂交桥梁探针（10 nm），在黑暗中，在摇杆上。此后，将读出检测探针（0.1μm）在室温下在室温下在杂交缓冲液中杂交1小时，用PBS洗涤两次，并在室温下用DAPI（0.5μgml -1）染色5分钟。将切片用PBS洗涤，并用约20μl的荧光素-G安装介质安装，并用盖玻片覆盖，并在4°C下储存直至成像。使用SlideView VS200滑动扫描仪（Olympus）拍摄图像，并使用Tissuumaps进行分析。
来自小的RNA-Seq样品的独立雄性用米尔瓦纳microRNA分离套件提取纯化的精子总RNA，并采用次要修改以确保完全裂解。根据制造商的协议（Applied Biosystems），使用7 ng的总RNA（n = 4）和NABX（N = 4）小鼠，使用预先设计的（miR-141-3p）和定制设计的（tRNA-gly-gly-gcc-2）测定法对miRNA和tRNA进行定量。按照标准程序（在95°C下为10分钟，在95°C下为10分钟，在60°C下1分钟，在60°C下1分钟，在15μl反应中进行了逆转录的定量PCR，在60°C下进行40个周期）。SNORNA202（Applied Biosystems）用作miRNA和tRNA水平归一化的内源性控制。将相对数量标准化为内源性对照值，并通过2- ∆ΔCT方法计算得出的折叠。通过模板运行的连续稀释来确认Taqman探针的扩增效率。
如参考文献中所述，使用SMART-SEQ协议进行了单embryo RNA-seq。70。对于质量控制和数据预处理，使用Star v.2.7.10a（参考71）在默认参数设置为MM10（GRCM38）主基因组组装时对准原始读取。使用子阅读v.2.0.1的特征伦敦模块（参考文献72）对数据进行了量化。在R中进行差异表达和PCA（v.4.1.2）。通过将原始计数传递到deseq2（v.1.34.0）软件包73中来执行差异表达式。VST函数用于在默认设置处将计数归一化，并且PCA使用了前500个可变基因。对于基因本体分析，使用metascape Web应用程序（https://metascape.org/gp/index.html）来推断基因本体论项的富集74。要测试的基因列表被上传到metascape作为文本文件。将“表达分析”选项既是将“输入为物种”和“物种分析”作为M. Musculus的参数选择。
使用精子基因组DNA纯化的Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen Hilden）进行总精子DNA的提取。DNA提取如下。将储存在-80°C的冷冻纯精子样品在冰中解冻；将100μl的DNA提取缓冲液（20 mM Tris Cl pH 8，20 mM EDTA，200 mM NaCl，4％SDS）含有80 mM二硫代硫代醇和12μLML -1的蛋白酶K的蛋白酶K。然后在Eppendorf Thermomixer上在56°C下孵育，直到确保完全精子裂解（约1小时），偶尔在孵育期间摇动以分散样品。孵育后，应用了用户开发的协议DY03（QIAGEN），用于从动物精子中纯化总DNA。BS-Seq库是根据制造商的说明使用TRUSEQ DNA甲基化库Prep Kit（Illumina）构建的。放大的库是多重的，并在Illumina NextSeq 500（PE75）上进行了测序。
按照制造商的说明，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）从对照或NABX衍生的F1后代（正常或SGR）肝脏中提取GDNA。在所有制造商的准则遵循所有制造商的指南之后，都使用了纳米光谱分光光度计和安捷伦贴纸系统（Agilent）的DNA的数量和质量，以确保DNA完整性数> 7。放大的库是多重的，并在Illumina Hiseq 4000（PE150）上进行了测序，以进行适当的深度。
所有用于液相色谱 - 质谱法（LC -MS）分析（包括水和乙腈（LC -MS级））的所有化学品均购自Fisher Scientific。在线质量校准的标准购自安捷伦技术。
从三个繁殖时间点中收集了睾丸样品，从CON和NABX处理的父亲雄性中收集：在治疗6周后立即在治疗戒断后4周（15周大的小鼠）和治疗戒断后8周（19周大的小鼠）。收集后，立即将样品在液氮中捕集，并存储在-80°C下。在检索时，将300μl冰冷的溶剂混合物（乙腈：甲醇：水，2：2：1）和两个碳化碳纤维珠，来自Qiagen的3 mm的含量，将其添加到每个睾丸样品中。使用Qiagen Tastuelyser II以30％强度统一样品，持续5分钟。将裂解样品在4°C下以12700 RCF离心10分钟。将等体积（125μl）的提取上清液转移到两个NUNC 96孔，V形板上，并在25°C下在Genevac离心浓缩剂（Genevac）中蒸发2小时。将浓缩样品储存在-80°C下，并将其重悬于20μL的相同溶剂混合物中以进行LC -MS分析。
使用Agilent Infinitylab Poroshell 120 EC-C18、3.0×150 mm2、2.7μm色谱柱和Agilent 1290 Infinity II LC系统与6550 ifunnel QTOF质谱仪耦合进行色谱分离。将柱温度保持在45°C，流速为0.4 ml min -1。使用以下移动相：流动阶段A-含0.1％甲酸的水流；和B流动B-乙腈，甲酸为0.1％。将5μl样品在5％流动相中注射，维持0.10分钟，然后在0.5分钟内进行线性梯度至30％B，然后在10分钟内线性梯度至95％B，并在95％B中保持1分钟。在每次样品注射之前，允许该色谱柱在起始条件下重新校准3分钟。质谱仪以正面和负扫描模式（50–1,700 m/z）的使用，具有以下源参数：VCAP，3,500 V；喷嘴电压，2,000 V；气温为275°C；干燥气体，13 l min -1;雾化器，45 psi；鞘温度，275°C；鞘气流，12 l min -1;Fragmentor，130 V；和Skimmer，0 V.使用第二个电离源和参考质量溶剂（119.0363和1033.9881 m/z的恒定流量（10 µL min -1）进行在线质量校准，分别为正操作模式为121.0509和922.0098，分别为正操作模式）。每个样品在正电离模式和负电离模式下分别测量。
MassHunter定性分析软件（Agilent Technologies，v.10.0）用于从获得的LC -MS数据中提取代谢特征。应用了以下设置：绝对高度的峰值滤波器：5,000个计数，限制指控状态为1，仅包括±H+电荷分子，复合质量评分大于80％。使用默认参数的质谱专业人士（Agilent，v.15.1）进行峰值比对和识别：2 MDA或20 ppm的质量公差，保留时间公差为0.2分钟或2％。提取和对齐功能被导出为.csv文件以进行进一步的数据分析
使用GraphPad Prism v.8.4.3图形软件和R v.3.6.2进行统计分析。F1后代体重和表型的显着差异是通过“嵌套”分析确定的，从而由唯一暴露的父亲（n）的数量（而不是由后代数（n）的数量）决定了复制的数量，这是更大的。因此，尽管我们通常每个实验生成n> 150个后代以稳健地捕获效应大小和部分穿透性表型，但从统计学上讲，每个人从同一父亲派生的每个人都在层次上嵌套在单个n值中。例如，嵌套的t检验比较了两个无与伦比的组（所有来自对照或失调父亲的F1后代）的平均值，为此，这些治疗组中存在一个嵌套因素（每个垃圾中共享父亲）。这是必要的，因为在代际研究中使用单个后代作为自变量将导致α错误率和虚假意义膨胀。通过两尾未配对的t检验分析了睾丸与体重比，胎儿术比和迷宫区域。使用Baptista-Pike方法和使用卡方检验确定的ORS的统计显着性计算了优势比（ORS）和95％置信区间（CI）。Kaplan – Meier方法用于通过对数秩（Mantel – Cox）检验进行比较的生存分析曲线。将ELISA校准曲线用双曲线（X为浓度）非线性回归模型拟合（R2> 0.99是可接受的曲线拟合）。
使用默认参数的MM10转录组组件（2020-A），使用10倍基因组CellRanger 6.1.2（参考75）中的计数模块对齐并映射原始读取。
所有后续步骤均在R（v.4.1.2）中使用Seurat软件包76进行。首先，根据三个参数（唯一分子标识符（NCOUNT_RNA; 1,000：5,000））对细胞进行过滤，检测到的唯一基因的数量（nfeature_rna; 500：5,000）和线粒体速率（百分比）（百分比）和核糖体率（百分比; ribibo; ribibo; 0:20） - 如下所述。然后，使用默认的Seurat聚类方法将NABX和CON样品分别聚类。在这两种情况下，都丢弃了没有唯一表达基因的簇（使用logfc.threshold = 0.5和min.pct = 0.5）的簇被丢弃。
然后，按照Seurat软件包的建议，使用默认参数设置以默认参数设置进行了NABX和CON样品。
然后使用唯一表达的标记基因聚类并注释集成的数据集。如上所述，没有显示出独特表达基因的簇被忽略。为了定义更细粒的注释，将体细胞和生殖细胞分为不同的seurat对象并分别聚集。
对于数据集中确定的每种单元格类型，使用logfc.threshold = 0.25和P_VAL_ADJ来识别NABX和CON单元之间的DEG函数。< 0.01.
Raw reads were quality trimmed using Trim Galore (0.4.3.1, -phred33 --quality 20 --stringency 1 -e 0.1 --length 20). These were mapped to the mouse mm10 (GRCm38) genome assembly using RNA Star (2.5.2b-0, default parameters except for --outFilterMultimapNmax 1000) and reads with a MAPQ score less than 20 were discarded to ensure that only unique-mapping high-quality alignments were used for analysis of gene expression. The data were quantified using the RNA-seq quantification pipeline for directional libraries in seqmonk software to generate log2 reads per million (RPM) or gene-length-adjusted (RPKM) gene expression values.
DEGs were determined using the DESeq2 package (v.1.24.0), inputting raw mapping counts and applying a multiple-testing adjusted P value (false discovery rate (FDR)) < 0.05 significance threshold. An extra foldchange filter of more than 2 was applied to generate final DEGs.
Principle component analyses of transcriptomes were computed in seqmonk and R statistical software using all expressed genes as input. These were defined as having an RPKM >在所有测定的样品中，至少有两个重复的0.1。
将兴趣的DEG或基因列表输入到字符串V.11.0数据库77中，并提取与Reactome和Kegg途径相关的富集分析，通过FDR等级进行过滤。
使用Fastx-Clipper卸下适配器；使用自定义Perl脚本将FASTQ文件转换为FASTA，并使用自定义Perl脚本保留了18-33个核苷酸的读数。使用Bowtie将读取与鼠标基因组版本MM10对齐，仅报告最佳对齐，并且需要0个不匹配（参数-v 0 -k 1 -k 1-最佳-SAM）。使用SamTools v.1.9将Alignment SAM文件转换为BAM文件，并使用BedTools v.2将BAM文件转换为床文件。为了定量miRNA相交的miRNA用来计算与已知的Musculus miRNA的位置重叠的读数数量（摘自Mirbase www.mirbase.org）。通过使用InterSectbed -C来计算与从tRNA扫描数据库（http://gtrnadb.ucsc.edu/genomes/eukaryota/eukaryota/mmmusc10/）下载的预测的鼠标tRNA坐标的读数的读数数量，从而计算了TRNA。PIWI相互作用的RNA坐标取自Ref。78并使用升降机转换为MM10。通过将26至32个核苷酸之间的RNA与U作为第一个核苷酸选择26至32个核苷酸之间的RNA进行定量，并使用相交-C将这些RNA与PIRNA坐标相交。
为了研究显着差异，使用DESEQ2和用于鉴定Benjamani – Hochberg多重测试校正后的显着差异的负二项式测试处理数据。
使用Trim Galore（0.4.3.1）对RAW FASTQ序列进行了质量和自适应序列，并使用Bismark（0.20.0）读取与MM10的读数，从5'端删除了前8 bp，而最后2 bp则从单端读取的3'中删除了最后2 bp。使用Bismark甲基化提取器工具从映射的读取中提取胞嘧啶甲基化状态。使用SEQMONK软件（1.44.0）分析全基因组甲基化调用，每个条件都有五个生物独立复制数据集。为了识别DMR，首先将基因组纳入包含50个连续CPG的滑动瓷砖，并使用DNA甲基化管道确定其甲基化状态。通过运行读取深度敏感的逻辑回归（p（adj）<0.05）来识别DMR，其中至少十个读取，并应用阈值以绝对变化20％的DNA甲基化。特定基因组特征的甲基化水平（例如，烙印）是使用Seqmonk中的DNA甲基化管道计算出的，而不是目标特征。
使用装饰仪（V.0.6.3）79对比对读数进行修剪，然后用Casadapt（v.2.3）80去除两种读数的前十个5'碱基。使用BWA MEM（BWA -0.7.17）81与Musculus Refence基因组（MM10）对齐，然后使用Samtools过滤之前（V.1.10）82使用标志“ -h -h -F 256 -f 2 -f 2 -q 30”视图，并使用Picard Toolkit（V.2.2.2.2.2.2.0.0）MarkDuplicateS8333333。使用GATK（v.4.1.6.0）84 haplotypeCaller称为SNP和小indels。对变体进行过滤以删除那些以少于30的位置质量（素质）的删除，该等位基因频率小于0.2或低一个位置覆盖率（滑动刻度），多个多个个体。使用Annovar（2020JNe07）Annotate_variation.pl85对变体功能区域进行注释。使用Delly2调用（V.0.8.7）86调用结构变体。
所有统计分析和情节均在R v.3.6.2（参考文献87）中进行。为了排除下游分析中的不良样品注入，比较了所有提取的代谢物特征（TIC）的总和（平均= 1.600×1010，范围，范围= [1.419×1010; 1.808×1010]），如果它们的TIC不在3 s.d之内，则将样品排除在外。从平均值（0不包括样本）。丢失的数据被归咎于固定阈值，设定为5,000个计数。精确的重复特征或特征属于（1）0.002 AMU（绝对阈值）或20 ppm（相对阈值）窗口和（2）A 0.15分钟（绝对阈值）或2％（相对阈值）保留时间窗口，被认为是分裂的峰，因此被认为是分裂的。计算睾丸重量与动物体重之间的相关性，以验证两个值之间没有显着相关性（COR = 0.1870，P = 0.2477）。因此，使用睾丸重量z得分来使弯曲强度低的面积标准化，以考虑从睾丸大小衍生的信号强度的变化。零方差的功能（1）；（2）是单身人士；（3）在不到75％的每个班级中存在的样本中都被删除。最后，在检查确切的重复功能或落入0.002 da或20 ppm窗口的特征后，将源自正和负模式得出的特征表折叠在一起；如果是这样，则保留具有较高平均强度的功能并保留两个注释。结果表包括所有30个样本和总共10,582种代谢特征。
从人类代谢组数据库（HMDB，https://hmdb.ca/)88,89中检索了注释，通过搜索具有完全相同质量的代谢物或在0.002 AMU或20 ppm的窗口中从单位型代谢物质量中搜索的代谢物。在场时，会检索几个注释。仅保留被注释的特征进行下游分析。此外，对于每种特征，从HMDB中检索了代谢物类和超类。
对于完整的数据集，PCA均已计算为90，并通过对所有代谢特征和注释功能进行抽样周进行了对其进行了分层之后。
Statistical significance of the feature intensity differences was assessed using a two-sided t-test (stats::t.test function in R) of log-scaled data and P values were FDR-corrected for several hypotheses testing using the Benjamini–Hochberg procedure (stats::p.adjust function in R with BH parameter).使用火山图可视化了调整后的P值和折叠。检索了所有特征的质量，保留时间，HMDB注释，类，超类和复合频谱，均显示处理组和对照组之间的强度显着不同，并且绝对折叠大于2。
使用Fisher的精确测试计算了处理组和对照组之间的代谢物类别和超类富集分析。使用Benjamini – Hochberg程序（统计数据:: p. adjust函数在r中，r bh参数）对几个假设测试进行了所有P值校正。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
