没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。
根据国家和国际准则维护小鼠。所有涉及动物受试者的实验均由耶鲁大学医学院的机构动物护理和使用委员会批准，并遵循批准的动物处理方案（协议：2023-20352）进行。在12小时的光线下，所有实验小鼠均保持在特定的无病原体条件下：黑暗周期温度控制的设施（在20–26°C介于20-26°C之间，湿度为30-70％），并免费获得水和食物，并从6周龄开始使用。所有小鼠均繁殖到混合的CD1白化背景。V. Greco提供了H2B-GFP：TCF-LEF51记者鼠标线。
为了在胃阶段收集体内胚胎，将5至7周龄的雌性CD1小鼠自然用12至24周龄的雄性CD1小鼠自然交配，并在涂料后牺牲6.5、6.75、7.0或7.25天。回收子宫，并在含有5％FBS，20 mM HEPES和1×青霉素 - 链霉菌素（Gibco）的DMEM培养基中从Deciduae中解剖胚胎，并升至37°。尚未确定胚胎的性别。
以1：12（Gibco）与大鼠血清（Envigo）为1：1的比例培养胚胎，具有1倍谷氨酸（Gibco），0.2×Penicillin-streptycin（Gibco）（Gibco）和0.2×MEM NEAA（Gibco），在20％O2和5％CO2。在培养前，将培养基在5％CO2中平衡≥15分钟。
在KSOM培养基植入前2细胞阶段（E1.5）处的小鼠胚胎通过冲洗从5至6周龄的CD1女性冲洗，通过注射10 IU怀孕的母马血清促性腺激素（Prospec），然后使用10 iu Human human Chorionic Gonadiropir（Sigotropir）（SIGMAREOPIN）（SIGMAREOPIN）（SIGMAROPIN）进行了超级排除。然后使用BTX胚胎操纵电细胞融合系统融合两细胞阶段的胚胎以诱导四倍体。将融合的胚胎转移到覆盖有矿物油（富士机）的高级KSOM（Sigma）中，并培养为胚泡阶段，直到注射胚胎干细胞。每个宿主四倍体胚泡均注入10-15个小鼠ES细胞，将注射的胚泡转移到制备的第2.5天CD1伪孕剂替代（6周大）的子宫中，这些替代物（6周龄）被血管切除的CD1雄性小鼠堵塞。这些小鼠胚胎干细胞衍生的胚胎是在某些发育时间轴上收集的，以通过子宫解剖进行后续实验（如上所述）。
除非另有说明，但在以下情况下给予化学抑制剂：2 mm 2-DG52（Santa Cruz Biotechnology），20 µM BRPA（Santa Cruz Biotechnology），10 µM PD0325901（Stemcell Technologies）（STEMCELL TECHNOLOGIES），10 µm SU5402（STEMCELL TENCELAGIN）100 µM寡霉素54 A（Santa Cruz Biotechnology），5 µM 6-AM55（Cayman Chemical），10 µM YZ98（Cayman Chemical），5 µM Shikonin56（Cayman Chemical）（Cayman Chemical）（Cayman Chemical）和5 µM Azaserine57和5 µm Azaserine57（Cayman Chieber或Santa Cruz Biotechnology）。将胚胎处理4小时，7小时，12小时或18小时。将中胚层植物处理3小时，12小时或16小时。如图标题所示，对实验的持续时间进行处理。蛋白聚糖硫酸化抑制剂NaClo3（Sigma）以20 mm的速度施用。以50 ng ml -1的速度应用FGF2，FGF4和FGF8（所有蛋白石）。
使用先进的DMEM/F -12培养基制备营养型培养基，并添加25 mM碳酸盐（Sigma）（Sigma）（Sigma），0.2×Penicillin -Stropteptopcoin（Gibco）（Gibco）（Gibco）和0.2××AAA（gibco）和0.2×××××aaA，并添加了25 mM碳酸盐（SIGMA）和0.2×PENICILIN -STROPHIN介质（SIGMA）和0.2××AAA，并添加了25 mM碳酸盐（SIGMA）和0.2×PENICILIN -NEA。根据每个实验条件，补充了以下营养素：17 mM葡萄糖（Gibco），0.5 mM丙酮酸钠（Gibco）和/或1×glutamax（Gibco）。对于半乳糖救援实验，补充到培养基的20 mm半乳糖（Sigma）。对于培养基的GlcNAC救援实验，补充到培养基中的1 mm或2 mM GlcNAC（Sigma）。所有胚胎均以定制DMEM和大鼠血清（Envigo）为1：1的比例培养。
将所有小鼠胚胎干细胞在20％O2和5％CO2中培养在37°C，一旦达到80％的汇合，就可以通过。通过PCR常规测试细胞对支原体污染。在含2i/LIF的含FBS的DMEM培养基中，将小鼠胚胎干细胞培养在2i/LIF（1μMMEKMEK抑制剂PD0325901、3μMGSK-3 GSK-3抑制剂CHIR99021和10 NG ML-1 LIF）中培养小鼠。含FBS的DMEM（GIBCO）培养基，包括：18％灭活FBS（Gibco），1.2×青霉素 - 链霉素（Gibco），1.2×谷胱甘肽（Gibco），1.2×MEM NEAA（GIBCO），1.2 mm钠含量（Gibco），1.2 mm钠含量（Gibco）和12-MERC-2-MERC-2-MERC-2-MERC- 2-MERC（MERC）和12-MERC（2-MERC）（2-MERC）（2-MERC）（2-MERC）（2-MERC）（2-MERC）（2-MERC）（12-MERC）（12-MERC）（12-MERC）（12-MERC）。本研究中使用的ERK-KTR小鼠胚胎干细胞来自Simon等人34（JAX 035333）。
对于体外小鼠胃类实验，我们按照所述20,21遵循该方案。如Dingare等人7中所述，用指定的药物培养日在3至4之间处理胃类药物，并固定以进行HCR染色或QPCR分析。
对于体外中胚层定向的分化实验，我们按照所述58进行了一些修改。在含10 ng ml-1 fgf2（R＆d系统）的含量为20,000的密度（R＆D系统）中，将细胞转移到6孔培养板或8孔µ玻片（IBIDI）后，将细胞转移（第0天）。用10 ng ml -1 fgf2在第1天处理细胞，在第2天用10 ng ml -1 fgf2和5 µm CHIR99021（Stemcell Technologies）处理细胞，在第3和4天和5 µm CHIR999021中处理。FGF2治疗后至少12小时开始在第1天或在第3天转换为中胚层状态的药物处理中。
对于从E7.25小鼠胚胎中隔离的中胚层，我们遵循所述修改的方案59。如上所述收集胚胎。去除羊膜外的胚外组织，并将杯状胚胎转移到由0.5％胰蛋白酶EDTA（Gibco）和2.5％胰腺（Thermo Scientific Chemicals）组成的分离培养基中，在4°C下15分钟。用收集培养基（前面描述）洗涤胚胎，并使用附着在注射器上的昆虫销（Roboz）解剖中胚层组织。将外植体转移到纤连蛋白涂层的18孔µ载玻片（IBIDI）板上，并在含有大鼠血清与胚胎培养基的1：4比率的培养基中粘附3-4小时（前面描述），然后在下游实验和/或化学抑制剂处理之前。为了进行迁移动态的实时成像，每5分钟将进行一次外植体，直到3小时。对于免疫荧光染色，将外植体培养长达17小时，并固定在含有4％多聚甲醛（PFA）的PBS中20分钟。为了进行RNA测序，将外植体培养至27小时，然后用无菌昆虫销和闪光冻结。
在早期条纹，中期和胃结构阶段收集小鼠胚胎，并用1 mM 2-NBDG60（Cayman Chemicals）培养2小时。对于多光子显微镜，立即实现胚胎。对于共聚焦显微镜，将胚胎固定在含有4％PFA的PBS中，持续15分钟，然后在PBS-T洗涤5分钟后立即成像（PBS-T（PBS为0.05％Tween-20）。
如前所述，细胞在8孔µ载玻片（同上）上进行了中胚层定向分化。在第2.5天，当细胞处于EPISC阶段时，用包括50 µg ML -1 DQ明胶（Invitrogen）的分化培养基培养细胞，然后在第3.5天固定在含有4％PFA 20分钟的PBS中，并免受光的保护。成像之前，将细胞与DAPI（在4°C或20分钟的室温下过夜）中孵育。
使用FITC-纤维蛋白（Sigma-Aldrich）和制造商的2天协议后，用FITC-纤维蛋白（Sigma-Aldrich）和0.1％明胶制备18孔µ载玻片（IBIDI），并保护了光。在将含有4％PFA的PBS固定20分钟之前，将外植体在这些板上培养16小时。在成像之前，将外植体与DAPI（在4°C或20分钟的室温下过夜）孵育（如下所述）。
在ES阶段收集小鼠胃，并用200 nm Mitotracker深红或100 nm四甲基二胺，甲基酯，高氯酸盐（TMRM）培养。根据下面描述的实时成像的相同参数，将胚胎培养在相应的染料中30分钟，然后在37°C和5％CO2的加湿室中成像。
将样品固定在含有4％PFA的PBS中，持续20-45分钟，或在甲醇中在4°C下在甲醇中固定20分钟。固定后，将样品用PBS-T（具有0.05％Tween-20）的PBS洗涤两次，并在室温下在1 mm甘氨酸和0.3％Triton X-100的PBS中透化20-60分钟。初级抗体孵育在阻塞缓冲液中在4°C（含有10％胎牛血清（FBS），10％Tween-20）的封闭缓冲液中进行了隔夜。在4°C的二级抗体在阻塞缓冲液中孵育之前，将样品用PBS-T洗涤两次。在最后一天，将样品用PBS-T洗涤两次，然后转移到PBS-A液滴中（PBS（含0.75％牛白蛋白分数V（Gibco））），然后在35毫米玻璃玻璃瓶中（Mattek）中覆盖矿物油（Sigma-Aldrich）。所有PBS-T洗涤均进行10分钟的室温，所有室温孵化或洗涤均在摇摆平台上进行。补充表1列出了本研究中使用的所有抗体。
使用HC PL APO CS2 40×/1.10或HC Fluotar L 25×/0.95 W Visir 0.17水目标，将样品与Leica Stellaris 5显微镜形成样品，Z间距为0.75 µm至5 µm，以及Alexa 405，Alexa 488，Alexa 488，Alexa 486和Alexa 486和Alexa 486和Alexa 486和Alexa 486和Alexa and alexa and Filters。为了在胚胎成像过程中纠正沿Z轴沿Z轴的荧光衰减，在对照胚胎中定义了“由AOTF和PMT进行的Z补偿”，并在该成像过程中在所有实验条件上应用，因此激光功率和增益的变化在整个条件上都是等效的，并且仅适用于每个Embryo的大小。使用开源图像分析软件fiji/imageJ2 2.9.0或AIVIA 10.5.1 AI图像分析软件并组装在Photoshop 2021 22.3.1（Adobe）或Illustrator 2024 28.6（Adobe）中。使用ImageJ的正交查看器从1 µM z间距的图像产生横向视图。使用图像j中的绘图测量值获得了数字定量和免疫荧光信号强度图，并在GraphPad Prism10.2.3中可视化。软件。
使用Leica Stellaris 5显微镜使用25×（HC Fluotar L 25×/0.95 W Visir 0.17）或40×（HC PL APO CS2 40×40×46），使用Leica Stellaris 5显微镜对胚胎，中胚层外植体和中胚层分化的细胞培养的共置延时成像进行了使用。Alexa 633或其组合。样品在具有37°C和5％CO2的加湿室下成像。在预处理的IBIDI菜肴（IBIDI）上以2 µm Z间距的2 µm间隔平面在2 µm Z间隔的平面（IBIDI）中成像。使用AIVIA处理图像，以下在“图像分析”下描述。
多色两光子显微镜用于NAD（P）H动力学的活体成像。胚胎保存在离体培养基中（前面描述），并添加了20 mM HEPE。使用具有变色龙视觉II的LA视觉饰面范围II（Lavision Biotec）激光扫描显微镜获取图像，并且在每个Z段15后顺序成像的不同波长，具有变色龙视觉II和Discovery Ultrafast激光器（相干）。H2B-GFP的NAD（P）H和940 nm的波长用于H2B-GFP：TCF-LEF或ERK-KTRMCLOVER REPORTER。尽管NAD（P）H和GFP的激发范围重叠，但它们的发射通过带通滤波器分离：蓝色范围（425-475 nm； NAD（P）H）和绿色范围（500-550 nm; FAD）。从NAD（P）H通道中排除了NAD（P）H和GFP的发射信号的分离的NAD（P）H通道的核GFP信号（在H2B-GFP：TCF-LEF胚胎中）。使用40×水浸入透镜（Nikon; Na 1.15）以400 Hz的比例大小为0.2 µm或0.3 µm，Z-STEP为1或1.5 µm，对胚胎进行成像。对于最佳的信噪比，对于所有NAD（P）H图像，完成了2个线平均。通过这种方法从还原的代谢产物中检测到的荧光捕获了NADH和NADPH（因此称为NAD（P）H）61。应该注意的是，非磷酸化NADH和NAD+的细胞内浓度远高于NAD（P）H和NADP+（参考文献62）。我们进一步验证了胚胎中NAD（P）H荧光信号密切共定位并遵循2-NBDG摄取。
所有胚胎在成像过程中沿A – P轴（请参阅数字）精确定位，以易于定量。
用于GLUT1和GLUT3和DAPI染色的胚胎的中间矢状切片，用于fiji/ImageJ2中的葡萄糖摄取定量。对于每个胚胎，将角顶点分配在上胚细胞和胚外外胚层之间的最近端边界，在后部最大（0°）和前较大（180°）的e薄膜之间的中点。计算每个胚胎（“ Glut Start”和“ Glut End”）的两个角度值，以捕获胚珠中可观察到的Glut表达的范围，以及胚胎的原始条纹远端长度以分配阶段（ES，MS或LS）（如上所述，ES，MS或LS）。计算每个阶段的“小启动”和“小末端”均值，并在带有rstudio的玫瑰图中可视化。
DAPI染色的胚胎的矩形矢状切片用于fiji/imagej2中的原始条纹远端伸长定量。对于每个胚胎，0％的截止值以前层形态为标记，将100％的截止分配给最远端的epiblast细胞，而“ PS”（原始条纹）在原始条纹形态延伸的远端远端点上标记（图2B）。获得了0％至100％介于0％和“ PS”之间的垂直距离的测量值，以便每个胚胎的原始条纹伸长百分比（0到PS除以0-100）的大小调整为其尺寸。因此，控制胚胎的原始条纹远端伸长百分比为95％（图2B）可以解释为“此胚胎将其原始条纹延长至其层状高度的95％”。可以通过此测量来分配Theiler阶段：ES≤50；MS的50至100;> 100。
层粘连蛋白和DAPI染色的胚胎的矩形矢状切片用于斐济/imagej2中的基底膜计算。对于每个胚胎，0％的截止值以前层形态为标志，将100％的截止分配给了最远端的epiblast细胞，并且在远端最多的点上标记了“完整的BM”，其中层粘连蛋白仍然是完整的（图2D）。获得了0％至100％介于0％和“ BM”之间的垂直距离的测量值，以便每个胚胎的地下膜分解百分比（0到BM除以0到100）的大小调整为其大小。因此，可以将控制胚胎的地下膜分解读数为96％（图2D），可以解释为“此胚胎已经分解了其垂直基底膜长度的96％”。
使用40倍物镜成像的DAPI染色的中胚层外植体的Z段用于纤连蛋白穿孔计算，每个外植体捕获了≥3张图像。对于每个图像，计算细胞数和穿孔数量。Invadapodia降解表示为百分比（穿孔数除以单元格）。
ERK-KTR胚胎的矢状切片用于量化ERK活性。使用ERK-KTR和BrightField通道来验证斐济/imagej2中每个细胞的手动分割，以描绘核和细胞质区域，以验证细胞形态（扩展数据图8B）。对于每个细胞，量化以下测量值：NA，细胞质区域CA（包括核），核ERK-KTR强度NI和核提取的细胞质ERK-KTR强度CI。为了计算核：细胞质比，将平均核强度（Ni/Na）除以平均细胞质强度（CI/（Ca -na）），因此比率≥1表示没有ERK活性。
用40倍物镜捕获的现场模仿视频用于在fiji/imagej2中手动量化的TCF-LEF报告者中胚层的增殖计数。对于每种epplant，在第一帧中计算了“起始人群”的总体细胞计数，并且在视频过程中仔细的框架对框架评估也分配了“细胞分裂”事件（TCF-Lef-Lef telephase观察）。然后为每种外植体获得一个扩散指数（细胞划分/起始人群），因此1的最高索引可以解释为“视频开始时的每个单元格除以视频的结尾”。然后将其调整为视频的总帧长度，以便可以比较不同实验重复和视频长度的外植物。因此，可以将读数为16.5％（图4B）的控制外植体解释为视频开始时的中胚层细胞的16 .5％，除以视频的结尾。
AIVIA 10.5.1 AI图像分析软件用于检查中胚层外植体迁移动力学。使用“细胞跟踪”配方生成核分割，该配方应用了一个像素分类器，该像素分类器在每个实验重复的每个治疗组的视频中都在TCF-FLEF核荧光通道上进行了训练（图4B）。在像素分类器的“预览”和训练的回合之间修改了参数值，以确保核分割精度。对Brightfield通道进行了手动检查，以验证检测准确性。在“轨道编辑器”中纠正了错误的谱系或从最终数据集中丢弃的谱系，并独立处理父母和女儿曲目。每个感兴趣的轨道测量都被导出到Excel并标准化为其检测长度（从“最后一帧”中减去了“第一帧”），以便可以比较不同检测长度的谱系。因此，将所有数据点绘制在µm min -1或µm s -1中。
Imaris 10.0.1软件用于计数T阳性，总和杂碳细胞。使用“表面”功能生成核分段。使用创建向导工具调整了背景扣除和形态分裂等参数，以识别最佳算法设置。与使用DAPI信号对健康细胞相比，使用增加背景减法的阈值在DAPI通道中计数增生细胞。相对于整个创建及其最终状态的原始染色，对表面进行了检查，以确保准确性。
使用RIPA缓冲液（Thermo Scientific 89900）提取蛋白质。将试剂补充有1倍蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，87786）和1倍磷酸酶抑制剂（Phos Stop Roche 4906845001），以防止提取过程中蛋白质降解和dephosphoration。使用Pierce BCA定量蛋白质浓度。蛋白质测定套件（Thermofisher，23225）按照制造商的说明。将蛋白质在95–100°C变性5分钟，在1×Nupage LDS样品缓冲液（Thermofisher，NP0007）中，含有10％V/Vβ-马erercaptoethanol（Millipore Sigma，M6250）。使用1×Tris/Glycine/SDS缓冲液（从Bio-Rad，1610732稀释）在110 V中使用4–20％预制的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，4568095）在110 V中使用4–20％的预制聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad，4568095）进行蛋白质电泳。按照制造商的说明，使用Bio-Rad Mini Trans-blot细胞在100 V时将蛋白质从凝胶上转移到硝酸纤维素膜（Thermofisher，IB301032）上。湿传递缓冲液为20％甲醇，200毫米甘氨酸和250毫米Tris。在室温下，膜在TBST中以5％的牛奶在5％的牛奶中阻塞1小时，并轻轻摇动。将原代抗体与膜在1小时的室温或4°C下孵育，以温和的摇动过夜。将膜在TBST中洗涤3次，每次5分钟，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下以5％非脂肪牛奶在5％的非脂肪牛奶中以1：5,000的比率孵育1小时。然后将印迹在TBST中洗涤3次，每人5分钟。在室温下，用SuperSignal West Femto最大敏感性底物（Thermofisher，34094）处理印迹。使用基于CCD摄像头的成像蛋白蛋白氟化物系统对印迹进行成像。
根据制造商的说明（Qiagen），使用RNeasy微型套件从细胞中提取总RNA。根据制造商的说明（Applied Biosystems），使用高容量cDNA逆转录试剂盒用1μg总RNA进行cDNA合成。使用Powerup Sybr Green PCR主混合（Applied Biosystems）测量mRNA的量。通过用GAPDH作为内源对照来评估转录本表达的相对水平。有关QPCR和逆转录的引物，请参见补充表2。
根据制造商的说明（Applied Biosystems），使用Picopure RNA隔离试剂盒从中胚层外植体中提取总RNA。将RNA样品提交给耶鲁大学基因组分析中心进行质量评估，图书馆制备和测序。每个RNA样品包含来自2个胚胎的外植体，每个条件都提交了2个样品。使用Star（v2.7.9a）将配对末端读数对齐与小鼠基因组（GRCM38）使用Ensembl转录组（Release 109）63对齐。使用DESEQ2（V1.40.1）对差异基因表达进行分析。为了鉴定样品之间的差异调节基因进行下游分析，我们选择了具有Log2转化的倍数变化大于0.7或小于-0.7的基因，并且调整后的P值<0.01。使用TOPGO（v2.52.0）使用“ stoge01”算法进行Fisher在R Studio上的精确测试（版本2023.12.1+402）进行基因本体分析。使用David（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)64,65进行KEGG途径分析。
使用MouseGastrulationData（v1.12.0）（https://github.com/marionilab/mousegastrulationdata）访问了先前发表的来自胃部小鼠胚胎的单细胞RNA测序数据。数据被子集以仅包括“层状”，“原始条纹”和“新生中胚层”细胞状态，从上演E6.5到E8.5的所有样品（样本1-10、12-20-20和23-37;样品11、21和21和21和22均被我们的分析中的分析省略，因为它们的分期是歧义的，例如，样品是'samplume as ass'as as as as as as os as as as os gastrumate'）。使用seurat（v。4.3.0）66,67,68,69,70对数进行对数均衡。首先将细胞随机下采样以可视化目的，每种细胞类型400个细胞。使用弹弓（v2.8.0）71进行原理曲线计算，进行了伪段和轨迹干扰分析。Singlecellexperiment（V1.22.0）72和Scaper（V.1.28.0）73用于可视化假期基因表达。然后将原理曲线追溯到前两个主要组件，以推断伪固定组织。
在GraphPad Prism 10.2.3软件上进行统计测试。为了比较两组，应用了两侧未配对的t检验。为了比较三个或多个组，使用了单向方差分析，然后进行了Dunnett的多重比较测试，用于对照或Tukey的多重比较测试进行比较，除非另有说明。p值显示在图面板或图例中。除非在方法和图中特定描述，否则所有实验至少在三个生物学重复中进行。图传说指示胚胎，细胞，外植体或干细胞结构的数量，并在相关时为每个分析执行的实验数量。统计功率计算未用于确定样本量。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
